microbeПроблемы особо опасных инфекцийProblems of Particularly Dangerous Infections0370-10692658-719XRussian Research Anti-Plague Institute “Microbe”10.21055/0370-1069-2018-3-60-65microbe-890Research ArticleОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИORIGINAL ARTICLESРазработка иммуноферментных моноклональных тест-систем для выявления возбудителей сапа и мелиоидозаDevelopment of Immuno-Enzymatic Monoclonal Tests-Systems for the Detection of Glanders and Melioidosis AgentsКытмановА. А.KytmanovA. A.23527@mil.ruЕлагинГ. Д.ElaginG. D.КуклинаГ. В.KuklinaG. V.ПеченкинД. В.PechenkinD. V.ФоменковО. О.FomenkovO. O.ЕремкинА. В.EremkinA. V.ИпатовС. С.IpatovS. S.ЗиганшинЭ. Р.ZiganshinE. R.Филиал ФГБУ «48 Центральный научно-исследовательский институт» Министерства обороны, КировРоссияAffiliated Branch of the Federal State Budgetary Institution «48th Central Research Institute» of the Ministry of Defense of the Russian Federation, KirovRussian Federation201804102018036065Copyright © Кытманов А.А., Елагин Г.Д., Куклина Г.В., Печенкин Д.В., Фоменков О.О., Еремкин А.В., Ипатов С.С., Зиганшин Э.Р., 20182018Кытманов А.А., Елагин Г.Д., Куклина Г.В., Печенкин Д.В., Фоменков О.О., Еремкин А.В., Ипатов С.С., Зиганшин Э.Р.Kytmanov A.A., Elagin G.D., Kuklina G.V., Pechenkin D.V., Fomenkov O.O., Eremkin A.V., Ipatov S.S., Ziganshin E.R.Данная работа распространяется под лицензией Creative Commons Attribution 4.0.This work is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 License.https://journal.microbe.ru/jour/article/view/890

Цель. Создание лабораторных  образцов  иммуноферментных  моноклональных  тест-систем  для  выявления возбудителей сапа и мелиоидоза. Материалы и методы. В работе использованы микробные культуры и гибридные клеточные линии, полученные из государственной коллекции микроорганизмов филиала ФГБУ «48 ЦНИИ» Минобороны России  (г. Киров). Клетки  гибридом  культивировали  в  перитонеальной  полости  мышей  линии BALB/с. Препараты сапных и мелиоидозных моноклональных антител выделяли из асцитных жидкостей осаждением сульфатом аммония и очисткой ионообменной хроматографией. Специфические компоненты создаваемых тест-систем  подвергали  сублимационному  высушиванию  в  соответствующих  защитных  средах. Исследование диагностических свойств разработанных тест-систем проводили методом непрямого твердофазного иммуноферментного анализа. Результаты и обсуждение. В результате работы получены препараты моноклональных антител in vivo, а также выделены и очищены иммуноглобулины из асцитных жидкостей. Подобраны пары моноклональных антител для изготовления специфических компонентов. Изготовлены лабораторно-экспериментальные серии  иммуноферментных  моноклональных  тест-систем,  позволяющие  специфически  выявлять  возбудителей сапа и мелиоидоза в концентрации 0,5·106 м.к./мл и более. Показано отсутствие перекрестных реакций с близкородственными сапрофитами и гетерологичными микроорганизмами в концетрации 1,0·108 м.к./мл. Показана принципиальная возможность проведения дифференциации Burkholderia mallei и Burkholderia pseudomallei методом иммуноферментного анализа. Тест-системы перспективны для последующей регистрации в качестве медицинских изделий для диагностики in vitro.

Objective of the study was the development of immune-enzymatic monoclonal test-kit for detecting glanders and melioidosis agents. Materials and methods. We used microbial cultures and hybrid cell lines obtained from the collection of the «48th Central Research Institute» of the Ministry of Defense of the Russian Federation. Hybridoma cells were incubated in the peritoneal cavity of BALB/c mice. Preparations of glanders and melioidosis monoclonal antibodies were isolated from the ascetic fluids through precipitation with ammonium sulfate and purification by means of ion-exchange chromatography. Specific components of the test-kits were subjected to freeze drying in corresponding protective media. Study of diagnostic properties of the developed test systems was performed using ELISA. Results and conclusions. We have obtained preparations of monoclonal antibodies in vivo, as well as isolated and purified immunoglobulins from ascetic fluids. We also selected the pairs of monoclonal antibodies for manufacturing specific components. Experimental series of immune-enzymatic monoclonal test-systems allowing for specific detection of glanders and melioidosis causative agents in concentrations ranging from 0.5·106 CFU/ml and higher were made. The absence of cross-reactivity with closely related saprophytes and heterologous microorganisms in concentrations of 1,0·108 CFU/ml was shown. Demonstrated was the possibility in principle to differentiate between Burkholderia malleiand Burkholderia pseudomallei using ELISA. Test systems are promising for follow up state registration as medical products for in vitro diagnostics.

сапмелиоидозмоноклональные антителаиммуноферментный анализglandersmelioidosismonoclonal antibodiesELISAReferencesКэтти Д., Редактор. Антитела. Методы. М.: Мир, 1991. Т. 1. 287 с.Ketti D, editor [Antibodies. Methods. Volume 1]. Translated from English. Moscow: “Mir”; 1991. 287 p.Замарина Т.В., Храпова Н.П., Корсакова И.И., Пименова Е.В. Конструирование экспериментальной тест-системы иммуноферментной на основе моноклональных антител к антигену 200 kDa возбудителя мелиоидоза. Вестник Волгоградского государственного медицинского университета. 2014; 3:93–95.Zamarina T.V., Khrapova N.P., Korsakova I.I., Pimenova E.V. [Designing of experimental immune-enzymatic test-system on the basis of monoclonal antibodies to melioidosis agent antigen 200 kDa]. Vestnik Volgogradskogo Gosudarstvennogo Meditsinskogo Universiteta. (Bulletin of the Volgograd State Medical University). 2014; 3:93–5.Прохватилова Е.В., Храпова Н.П. О получении моноклональных люминесцирующих иммуноглобулинов для обнаружения возбудителя мелиоидоза. В кн.: эколого-эпидемиологический надзор за природно-очаговыми инфекциями в Северном Прикаспии. Астрахань; 1996. с. 147–8.Prokhvatilova E.V., Khrapova N.P. [Concerning the obtainment of luminescent monoclonal immunoglobulins for the detection of melioidosis causative agent]. In: [Ecological-epidemiological sur-veillance over natural focal infections in the Northern Caspian Sea region]. Astrakhan; 1996. P. 147–8.Прохватилова Е.В. О разработке новых иммунобиологических препаратов на основе моноклональных антител к Burkholderia malleiи Burkholderia pseudomallei. Проблемы особо опасных инфекций. 2003; 2:153–8.Prokhvatilova E.V. [Concerning the development of new immune-biological preparations based on monoclonal antibodies to Burkholderia mallei and Burkholderia pseudomallei. Problemy Osobo Opasnykh Infektsii [Problems of Particularly Dangerous Infections]. 2003; 2:153–8.Cheng A.C., Currie B.J. Melioidosis: epidemiology, pathophysiology and management. Clin. Microbiol. Rev. 2005; 18(2):383–416. DOI: 10.1128/CMR.18.2.383-416.2005.Cheng A.C., Currie B.J. Melioidosis: epidemiology, pathophysiology and management. Clin. Microbiol. Rev. 2005; 18(2):383–416. DOI: 10.1128/CMR.18.2.383-416.2005.Harvey S.P., Minter J.M. Ribotyping of Burkholderia mallei isolates.FEMS Immunol. Med. Microbiol. 2005. 44(1):91–7. DOI: 10.1016/j.femsim.2004.12.002.Harvey S.P., Minter J.M. Ribotyping of Burkholderia malleiisolates.FEMS Immunol. Med. Microbiol.2005. 44(1):91–7. DOI: 10.1016/j.femsim.2004.12.002.Khrapova N.P., Tikhonov N.G., Prokhvatilova Y.V. Detection of Glycoprotein of Burkholderia pseudomallei. Emerg. Infect. Dis. 1998; 4(2):336–7. DOI: 10.3201/eid0402.980229.Khrapova N.P., Tikhonov N.G., Prokhvatilova Y.V. Detection of Glycoprotein of Burkholderia pseudomallei. Emerg. Infect. Dis. 1998; 4(2):336–7. DOI: 10.3201/eid0402.980229.Nakane P.K., Kawaoi A. Peroxidase-labeled antibody. A new method of conjugated J. Histochem. Cytochem. 1974; 22(12):1084–91. DOI: 10.1177/22.12.1084.Nakane P.K., Kawaoi A. Peroxidase-labeled antibody. A new method of conjugated J. Histochem. Cytochem. 1974; 22(12):1084–91. DOI: 10.1177/22.12.1084.Sudhir K. Dohre, Urmil Tuteja, Subodh Kumar Generation and Characterization of Monoclonal Antibodies Specific to Burkholderia mallei. Int. J. Curr. Microbiol. App. Sci. 2016; 5(5):342–9. DOI: 10.20546/ijcmas.2016.505.035.Sudhir K. Dohre, Urmil Tuteja, Subodh Kumar Generation and Characterization of Monoclonal Antibodies Specific to Burkholderia mallei. Int. J. Curr. Microbiol. App. Sci. 2016; 5(5):342–9. DOI: 10.20546/ijcmas.2016.505.035.Woods K.L., Boutthasavong L., NicFhogartaigh C., Lee S.J., Davong V., AuCoin D.P., Dance D.A.B. Evaluation of a rapid diagnostic test for detection of Burkholderia pseudomallei in the Lao People’s Democratic Republic. J. Clin. Microbiol. 2018; 56(7):e02002–17. DOI: 10.1128/jcm.02002-17.Woods K.L., Boutthasavong L., NicFhogartaigh C., Lee S.J., Davong V., AuCoin D.P., Dance D.A.B. Evaluation of a rapid diagnostic test for detection of Burkholderia pseudomallei in the Lao People’s Democratic Republic. J. Clin. Microbiol. 2018; 56(7):e02002–17. DOI: 10.1128/jcm.02002-17.Zhang S., Feng S.H., Li B., Kim H.Y., Rodriguez J., Tsai S, Lo S.C. In vitroand in vivostudies of monoclonal antibodies with prominent bactericidal activity against Burkholderia pseudomallei andBurkholderia mallei. Clin. Vaccine Immunol.2011; 18(5):825–34. DOI: 10.1128/CVI.00533-10.Zhang S., Feng S.H., Li B., Kim H.Y., Rodriguez J., Tsai S, Lo S.C. In vitroand in vivostudies of monoclonal antibodies with prominent bactericidal activity against Burkholderia pseudomallei andBurkholderia mallei. Clin. Vaccine Immunol. 2011; 18(5):825–34. DOI: 10.1128/CVI.00533-10.

The authors declare that there are no conflicts of interest present.