microbeПроблемы особо опасных инфекцийProblems of Particularly Dangerous Infections0370-10692658-719XRussian Research Anti-Plague Institute “Microbe”10.21055/0370-1069-2018-3-78-82microbe-989Research ArticleОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИORIGINAL ARTICLESРазработка иммуноферментной тест-системы для выявления Bacillus anthracisDevelopment of Enzyme-Immunoassay for Bacillus anthracis DetectionПеченкинД. В.PechenkinD. V.23527@mil.ruФоменковО. О.FomenkovO. O.ЕремкинА. В.EremkinA. V.ЕлагинГ. Д.ElaginG. D.КуклинаГ. В.KuklinaG. V.БарамзинаГ. В.BaramzinaG. V.ИпатовС. С.IpatovS. S.Филиал ФГБУ «48 Центральный научно-исследовательский институт» Министерства обороны, КировРоссияBranch of the «48th Central Research Institute» of the Ministry of Defense of the Russian Federation, KirovRussian Federation201805102018037882Copyright © Печенкин Д.В., Фоменков О.О., Еремкин А.В., Елагин Г.Д., Куклина Г.В., Барамзина Г.В., Ипатов С.С., 20182018Печенкин Д.В., Фоменков О.О., Еремкин А.В., Елагин Г.Д., Куклина Г.В., Барамзина Г.В., Ипатов С.С.Pechenkin D.V., Fomenkov O.O., Eremkin A.V., Elagin G.D., Kuklina G.V., Baramzina G.V., Ipatov S.S.Данная работа распространяется под лицензией Creative Commons Attribution 4.0.This work is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 License.https://journal.microbe.ru/jour/article/view/989

Цель. Создание иммуноферментной тест-системы для выявления спор Вacillus anthracis. Материалы и методы. В работе использованы штаммы из государственной коллекции микроорганизмов филиала ФГБУ «48ЦНИИ» Минобороны России (г.Киров) и мыши линии BALB/c. Гибридизацию В-лимфоцитов и миеломных клеток SP2/0-Ag14 проводили по методике G. Kohler и C. Milstein в модификации De St. Fazekas и P. Scheidegger. Клетки гибридом культивировали в перитонеальной полости мышей линии BALB/с. Моноклональные антитела выделяли из асцитных жидкостей осаждением сульфатом аммония и очисткой ионообменной хроматографией. Исследование специфической активности супернатантов гибридом, асцитных жидкостей, очищенных моноклональных антител  проводили  «сэндвич» - методом  иммуноферментного  анализа. Специфические  компоненты  создаваемых тест-систем подвергали сублимационному высушиванию в соответствующих защитных средах. Результаты и выводы. Получены гибридные клеточные линии, продуцирующие специфические моноклональные антитела к споровым  антигенам В. anthracis,  и  асцитные  жидкости,  из  которых  выделены  иммуноглобулины. Подобраны оптимальные сочетания моноклональных антител в качестве сенситина и в составе иммуноферментного конъюгата. Наибольшую чувствительность иммуноферментного анализа при выявлении споровых антигенов сибиреязвенного микроба обеспечила пара сенситин–конъюгат: 272E10G1–272F7A10. Определена оптимальная концентрация иммуноглобулинов для сенсибилизации планшета. Разработана иммуноферментная тест-система для вы-явления спор В. anthracisс пределом обнаружения 5,0·105 спор/мл. Показано отсутствие перекрестных реакций с близкородственными сапрофитами и гетерологичными микроорганизмами в концентрации 1,0·108 м.к./мл.

Objective of the study was to develop enzyme-immunoassay test-kit for the detection of Bacillus anthracis spores. Materials and methods. Microbial cultures from the State Collection of Microorganisms at the premises of Affiliated Branch of the «48th Central Research Institute» of the Ministry of Defense of the Russian Federation and BALB/c mice were used in the research. Hybridization of B-lymphocytes with SP2/0-Ag14 myeloma cells was performed according to G. Kohler and C. Milstein procedure in De St. Fazekas and P. Scheidegger modification. Hybridomas were cultured in the peritoneal cavity of BALB/c mice. Ascitic fluids were isolated from mice, precipitated with ammonium sulfate and purified by means of ion-exchange chromatography for preparation of monoclonal antibodies. Specific activity of hybridoma’s supernatants, ascitic fluids, purified monoclonal antibodies was studied by «sandwich» ELISA. Specific components of test-kit were lyophilized in suitable cryoprotective medium. Results and conclusions.We have obtained new hybrid cell lines producing specific monoclonal antibodies against Bacillus anthracisspore antigens and ascitic fluids from which immunoglobulins were isolated. Optimum combinations of monoclonal antibodies as a sensitizer and a component of immunoperoxidase conjugates have been selected. Monoclonal antibodies 272E10G1-272F7A10 provide the highest sensitivity of ELISA for the detection of anthrax microbe spore antigens. Our enzyme-immunoassay test allows for identification of Bacillus anthracis spores in concentrations up to 5,0·105 spores per milliliter. No cross reaction with closely related saprophytes and other heterologous microorganisms in concentrations of 1,0·108 CFU per milliliter is observed.

сибирская язвамоноклональные антителаиммуноферментный анализanthraxmonoclonal antibodiesenzyme-linked immunosorbent assayReferencesЕременко Е.И., Рязанова А.Г., Буравцева Н.П. Современная ситуация по сибирской язве в России и мире. Основные тенденции и особенности. Проблемы особо опасных инфекций. 2017; 1:65–71. DOI: 10.21055/0370-1069-2017-1-65-71.Yeremenko E.I., Ryazanova A.G., Buravtseva N.P. [Current situation on anthrax in Russia and in the world. Main trends and features]. Problemy Osobo Opasnykh Infektsii [Problems of Particularly Dangerous Infections]. 2017; 1:65–1. DOI: 10.21055/0370-1069-2017-1-65-71.Кэтти Д., Редактор. Антитела. Методы. М.: Мир; 1991. Т. 1. 287 С.Ketti D., editor. [Antibodies. Methods]. Moscow: “Mir”, 1991. Vol. 1. 287 p.Нетрусов А.И., Редактор. Практикум по микробиологии: Учеб. пособие для студ. высш. учеб. заведений. М.: Издательский центр «Академия»; 2005. 608 с.Netrusov A.I, editor. [Workshop on microbiology: Textbook for students of Higher Educational Institutions]. Moscow: «Academia»; 2005. 608 p.Онищенко Г.Г., Кожухов В.В., Редакторы. Сибирская язва: актуальные проблемы разработки медицинских средств защиты. М.: ОАО «Издательство «Медицина»; 2010. 424 с.Onischenko G.G., Kozhukhov V.V., editors. [Anthrax: relevant problems of elaboration of medical means of protection]. Moscow: Open Joint Stock Company «Publishing house «Medicine»; 2010. 424 p.Онищенко Г.Г., Кутырев В.В., Редакторы. Лабораторная диагностика опасных инфекционных болезней. Практическое руководство. М.: ЗАО «Шико»; 2013. 560 с.Onishchenko G.G., Kutyrev V.V., editors. [Laboratory Diagnostics of Dangerous Infectious Diseases. Practice guidelines]. M.: CJSC «Shiko»; 2013. 560 p.Павлов Д.Л., Онучина Н.В., Кузнецовский А.В., Фоменков О.О., Туманов А.С. Результаты исследования биологических и генетических свойств сибиреязвенных изолятов эпизоотии 2016 года в Ямало-Ненецком автономном округе. Вестник войск РХБ защиты. 2017; 1(1):23–32.Pavlov D.L., Onuchina N.V., Kuznetsovsky A. V., Fomenkov O.O., Tumanov A. S. [Results of the study of biological and genetic properties of anthrax isolates obtained during epizooty, 2016 in the Yamal-Nenets Autonomous District]. Vestnik Voisk Radiotsionnoi, Khimicheskoi i Biologicheskoi Zashchity. 2017; 1(1):23–32.Терешкина Н.Е., Девдариани З.Л. Современное состояние проблемы иммунодетекции возбудителя сибирской язвы. Проблемы особо опасных инфекций. 2008; 1:44–8.Tereshkina N.E., Devdariani Z.L. [Present status of the anthrax pathogen immunodiagnosis]. Problemy Osobo Opasnykh Infektsii [Problems of Particularly Dangerous Infections]. 2009; 1(95): 44–8.Bartholomew R.A., Ozanich R.M., Arce J.S., Engelmann H.E., Heredia-Langner A., Hofstad B.A., Hutchison J.R., Jarman K., Melville A.M., Victry K.D., Bruckner-Lea C.J. Evaluation of Immunoassays and General Biological Indicator Tests for Field Screening of Bacillus anthracis and Ricin. Health Secur. 2017; 15:81–95. DOI: 10.1089/hs.2016.0044.Bartholomew R.A., Ozanich R.M., Arce J.S., Engelmann H.E., Heredia-Langner A., Hofstad B.A., Hutchison J.R., Jarman K., Melville A.M., Victry K.D., Bruckner-Lea C.J. Evaluation of Immunoassays and General Biological Indicator Tests for Field Screening of Bacillus anthracis and Ricin. Health Secur. 2017; 15:81–95. DOI: 10.1089/hs.2016.0044.Fazekas de St. Groth S., Scheidegger D. Production of monoclonal antibodies: strategy and tactics. J. Immunol. Meth. 1980; 35:1–21.Fazekas de St. Groth S., Scheidegger D. Production of monoclonal antibodies: strategy and tactics. J. Immunol. Meth. 1980; 35:1–21.Köhler G., Milstein C. Continuous culture of fused cells secreting antibody of predefined specificity. Nature. 1975; 256(5517):495–7.Köhler G., Milstein C. Continuous culture of fused cells secreting antibody of predefined specificity. Nature. 1975; 256(5517):495–7.Lowry O.H., Rosebrough N.J., Farr A.L., Randall R.J. Protein measurement with the Folin phenol reagent. J. Biol. Chem. 1951; 193 (1):265–75.Lowry O.H., Rosebrough N.J., Farr A.L., Randall R.J. Protein measurement with the Folin phenol reagent. J. Biol. Chem. 1951; 193 (1):265–75.Nakane P.K., Kawaoi A. Peroxidase-labeled antibody a new method of conjugated. J. Histochem. Cytochem. 1974; 22(12):1084–1091.Nakane P.K., Kawaoi A. Peroxidase-labeled antibody a new method of conjugated. J. Histochem. Cytochem. 1974; 22(12):1084–1091.Wang D.-B., Yang R., Zhang Z.-P., Bi L.-J., You X.Y., Wei H.P., Zhou Y.F., Yu Z., Zhang X.E. Detection of B. anthracisspores and vegetative cels with the same monoclonal antibodies. PLoS ONE. 2009; 4(11): e7810. DOI: 10.1371/journal.pone.0007810.Wang D.-B., Yang R., Zhang Z.-P., Bi L.-J., You X.Y., Wei H.P., Zhou Y.F., Yu Z., Zhang X.E. Detection of B. anthracisspores and vegetative cels with the same monoclonal antibodies. PLoS ONE. 2009; 4(11): e7810. DOI: 10.1371/journal.pone.0007810.

The authors declare that there are no conflicts of interest present.