microbeПроблемы особо опасных инфекцийProblems of Particularly Dangerous Infections0370-10692658-719XRussian Research Anti-Plague Institute “Microbe”10.21055/0370-1069-2018-3-88-93microbe-991Research ArticleОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИORIGINAL ARTICLESМаркерные локусы генома бруцелл для дифференциальной ПЦР индикации патогенных штаммовMarker Loci in Brucella Genome for Differential PCR Indication of Pathogenic strainsХаммадовН. И.KhammadovN. I.

420075, Татарстан, г.Казань, Научный городок-2

Nauchniy Gorodok-2, Kazan, Tatarstan, 420075

nikhammadov@mail.ruОсянинК. А.OsyaninK. A.

420075, Татарстан, г.Казань, Научный городок-2

Nauchniy Gorodok-2, Kazan, Tatarstan, 420075

vnivi@mail.ruУсольцевК. В.Usol’tsevK. V.

420075, Татарстан, г.Казань, Научный городок-2

Nauchniy Gorodok-2, Kazan, Tatarstan, 420075

vnivi@mail.ruФаизовТ. Х.FaizovT. Kh.

420075, Татарстан, г.Казань, Научный городок-2

Nauchniy Gorodok-2, Kazan, Tatarstan, 420075

vnivi@mail.ruХаммадоваА. В.KhammadovaA. V.

420008, Татарстан, г.Казань, ул.Кремлевская, 18

18, Kremlyovskaya St., Kazan, Tatarstan, 420008

ecology@kpfu.ruШуралевЭ. А.ShuralevE. A.

Федеральный центр токсикологической, радиационной и биологической безопасности, 420075, Татарстан, г.Казань, Научный городок-2;

Казанский (Приволжский) федеральный университет, 420008, Татарстан, г.Казань, ул. Кремлевская, 18;

Казанская государственная медицинская академия – филиал ФГБОУ ДПО РМАНПО Минздрава России, 420012, Татарстан, г.Казань, ул. Бутлерова, 36.

Federal Center for Toxicological, Radiation and Biological Safety; Nauchniy Gorodok-2, Kazan, Tatarstan, 420075, Russian Federation.

Kazan Federal University; 18, Kremlyovskaya St., Kazan, Tatarstan, 420008, Russian Federation.

Kazan State Medical Academy; 36, Butlerova St., Kazan, Tatarstan, 420012, Russian Federation

ФГБНУ «Федеральный центр токсикологической, радиационной и биологической безопасности», КазаньРоссияFederal Center for Toxicological, Radiation and Biological Safety, KazanRussian FederationФГАОУ ВО «Казанский (Приволжский) федеральный университет», КазаньРоссияKazan Federal University, KazanRussian FederationФГБНУ «Федеральный центр токсикологической, радиационной и биологической безопасности», Казань; ФГАОУ ВО «Казанский (Приволжский) федеральный университет», Казань; Казанская государственная медицинская академия – филиал ФГБОУ ДПО РМАНПО Минздрава России, КазаньРоссияFederal Center for Toxicological, Radiation and Biological Safety, Kazan; Kazan Federal University, Kazan; Kazan State Medical Academy, KazanRussian Federation201805102018038893Copyright © Хаммадов Н.И., Осянин К.А., Усольцев К.В., Фаизов Т.Х., Хаммадова А.В., Шуралев Э.А., 20182018Хаммадов Н.И., Осянин К.А., Усольцев К.В., Фаизов Т.Х., Хаммадова А.В., Шуралев Э.А.Khammadov N.I., Osyanin K.A., Usol’tsev K.V., Faizov T.K., Khammadova A.V., Shuralev E.A.Данная работа распространяется под лицензией Creative Commons Attribution 4.0.This work is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 License.https://journal.microbe.ru/jour/article/view/991

Цель работы  направлена  на  разработку  алгоритмов  дифференциальной ПЦР индикации  бактерий  рода Brucellaс использованием баз данных их геномов. Материалы и методы. В работе использовались ресурсы Национального центра биотехнологической информации (NCBI) и программные утилиты «BLAST» и «Vector NTI 9.1.0». Для ПЦР амплификации использовались нуклеиновые кислоты B. suis, B. abortus, B. melitensis,а также плазмидная ДНК с маркерными вставками. Результаты и обсуждение. Проанализированы последовательности генов бруцелл, одни из которых имеются у бактерий рода Brucella, другие лишь у представителей вида B. melitensis, третьи лишь у представителей вида B. abortus. В результате дизайна праймеров и зондов для индикации бактерий рода Brucella и представителей видов B. melitensis и B. abortus установлены критерии, позволяю-щие амплифицировать маркерные последовательности этих бактерий, с одновременной их дифференциацией в условиях одной реакции. Определение штаммовых различий в пределах одного вида бруцелл описано в методике мультилокусного VNTR анализа, а профили тандемных повторов различных штаммов B. melitensis и B. abortus имеются в открытом доступе. Для контроля хода амплификации разработан положительный контроль, имеющий нуклеотидную последовательность всех маркерных областей. По тексту статьи указаны все нуклеотидные последовательности праймеров, зондов и положительного контроля, что предоставляет возможность самостоятельного их приобретения в компетентных организациях.

Objective of this work was to develop the algorithms for differential PCR indication of Brucella genus strains using databases of their genomes. Materials and methods .Resources of the National Center for Biotechnology Information (NCBI) and BLAST and Vector NTI 9.1.0 software utilities. For PCR amplification, B. suis, B. abortus, B. melitensis nucleic acids, as well as plasmid DNA with marker insertions were used. Results and conclusions. We assessed brucella gene sequences, some of which are found in Brucella genus bacteria, others only in representatives of B. melitensis, and the third ones – only in representatives of B. abortus. As a result of primers and probes designing for indication of Brucella genus bacteria and representatives of B. melitensis and B. abortus species, criteria for marker sequence amplification have been established. These criteria provide for simultaneous differentiation in a single reaction. The determination of strain differences within one species of Brucella is described in multilocus VNTR assay technique, and the profiles of tandem repeats of various B. melitensis and B. abortus strains are available in the public domain. To monitor the progress of amplification, a positive control has been developed that has the nucleotide sequence of all marker regions. The text of the paper discloses all the nucleotide sequences of primers, probes and positive control, which makes it possible to independently acquire them in competent organizations.

бруцеллыиндикациядифференциациявидштаммПЦРMLVABrucellaindicationdifferentiationspeciesstrainPCRMLVAReferencesАгольцев В.А., Веселовский С.Ю., Частов А.А., Попова О.М. Эпидемиологические и эпизоотологические особенности бруцеллеза в Саратовской и в Западно-Казахстанской областях. Научная жизнь. 2017; 7:92–100.Agol’tsev V.A., Veselovsky S.Yu., Chastov A.A., Popova O.M. [Epidemiological and epizootiological features of brucellosis in the Saratov and West Kazakhstan Regions]. Nauchnaya zhizn’. 2017; 7:92–100.Адиева А.А, Израилова Г.Р., Халилов Р.А., Меджидова М.Г., Умарова Ю.А. Использование биоинформационных методов при конструировании праймеров конститутивного гена, кодирующего белок тубулин для проведения от-пцр. Современные проблемы науки и образования. 2016; 6:526–33.Adieva A.A., Izrailova G.R., Khalilov R.A., Medzhidova M.G., Umarova Yu.A. [The use of bioinformation techniques in constructing primers of a constitutive gene encoding a tubulin protein for RT-PCR]. Sovremennye problemy nauki i obrazovaniya. 2016; 6:526–33.Александрова Н.М., Хаммадов Н.И., Шуралев Э.А., Елизарова И.А. Дифференциальная диагностика туберкулеза у человека и животных с применением мультиплексной тест-системы. Молекулярная диагностика: сб. трудов IХ Всерос. науч.-практич. конференции с междунар. участием. Тамбов: ООО «Юлис»; 2017. т. 1. с. 493.Aleksandrova N.M., Khammadov N.I., Shuralev E.A., Elizarova I.A. [Differential diagnosis of tuberculosis in humans and animals using a multiplex test system].Molecular Diagnostic: Proceeding of IX Russian Research Conference with international participation. Tambov: «Yulis»; 2017. Vol. 1. P. 493.Желудков М.М., Церельсон Л.Е. Резервуары бруцеллезной инфекции в природе. Зоологический журнал. 2010; 89(1):53–60.Zheludkov M.M., Tserel’son L.E.[The reservoirs of brucellosis infection in nature]. Zoologicheskii Zhurnal.2010; 89(1):53–60.Лямкин Г.И., Головнева С.И., Худолеев А.А., Чеботарева Е.Н., Шакирова Л.И., Куличенко А.Н. Обзор эпизоотической и эпидемической ситуации по бруцеллезу в российской Федерации в 2013 г. и прогноз на 2014 г. Проблемы особо опасных инфекций. 2014; 2:29–32. DOI: 10.21055/0370-1069-2014-2-29-32.Lyamkin G.I., Golovneva S.I., Khudoleev A.A., Chebotareva E.N., Shakirova L.I., Kulichenko A.N. [Review of epizootic and epidemic situation on brucellosis in the Russian Federation in 2013 and the forecast for 2014]. Problemy Osobo Opasnykh Infektsii. 2014; 2:29–32. DOI: 10.21055/0370-1069-2014-2-29-32.Ндайишимийе Э.В., Хаммадов Н.И., Осянин К.А., Фаизов Т.Х., Шуралев Э.А., Мукминов М.Н. Биоинформационный анализ олигонуклеотидов для молекулярно-генетической индикации возбудителей аспергиллеза и аскосфероза пчел. Ветеринарный врач. 2015; 2:3–9.Ndayishimiye E.V, Khammadov N.I., Osyanin K.A., Faizov T.Kh., Shuralev E.A., Mukminov M.N. [Bioinformatics analysis of oligonucleotides for molecular-genetic indication of pathogens of bees aspergillosis and ascosphereosis]. Veterinarny Vrach. 2015; 2:3–9.Садикалиева С.О., Строчков В.М., Орынбаев М.Б., Шораева К.А., Еспембетов Б.А., Сансызбай А.Р., Султанкулова К.Т. Молекулярно-генетическое типирование бактерии рода Brucella, циркулирующих в Республике Казахстан. Вестник башкирского университета. 2017; 22(2):403–8.Sadikalieva S.O., Strochkov V.M., Orynbaev M.B., Shoraeva K.A., Espembetov B.A., Sansyzbay A.R., Sultankulova K.T. [Molecular-genetic typing of Brucella genus bacteria circulating in the Republic of Kazakhstan]. Vestnik Bashkirskogo Universiteta. 2017; 2(22):403–8.Сафина Г.М., Фомин А.М., Косарев М.А. Апробация новой системы специальных противобруцеллезных мероприятий на заключительном этапе оздоровления хозяйств от бруцеллеза крупного рогатого скота. Ветеринарный врач. 2016; 4:12–5.Safina G.M., Fomin A.M., Kosarev M.A. [Approbation of a new system of special anti-brucellosis measures at the final stage of farms’ rehabilitation from brucellosis in cattle]. Veterinarny Vrach. 2016; 4:12–5.García-Yoldi D., Marín C.M., de Miguel M.J., Muñoz P.M., Vizmanos J.L., López-Goñi I. Multiplex PCR assay for the identification and differentiation of all Brucellaspecies and the vaccine strains Brucella abortusS19 and RB51 and Brucella melitensisRev1. Clin. Chem. 2006; 52(4):779–81. DOI: 10.1373/clinchem.2005.062596.García-Yoldi D., Marín C.M., de Miguel M.J., Muñoz P.M., Vizmanos J.L., López-Goñi I. Multiplex PCR assay for the identification and differentiation of all Brucellaspecies and the vaccine strains Brucella abortusS19 and RB51 and Brucella melitensisRev1. Clin. Chem. 2006; 52(4):779–81. DOI: 10.1373/clinchem.2005.062596.Kang S.I., Her M., Kim J.W., Kim J.Y., Ko K.Y., Ha Y.M., Jung S.C. Advanced multiplex PCR assay for differentiation of Brucella species. Appl. Environ. Microbiol. 2011; 77(18):6726–8. DOI: 10.1128/AEM.00581-11.Kang S.I., Her M., Kim J.W., Kim J.Y., Ko K.Y., Ha Y.M., Jung S.C. Advanced multiplex PCR assay for differentiation of Brucella species. Appl. Environ. Microbiol. 2011; 77(18):6726–8. DOI: 10.1128/AEM.00581-11.Khammadova A.V., Shuralev E.A., Khammadov N.I., Oumarou B.M., Faizov T.K., Mukminov M.N. Design of primers for identification of honey bee viruses in multiplex-PCR. Astra Salvensis.2017; 5(1):481–9.Khammadova A.V., Shuralev E.A., Khammadov N.I., Oumarou B.M., Faizov T.K., Mukminov M.N. Design of primers for identification of honey bee viruses in multiplex-PCR. Astra Salvensis.2017; 5(1):481–9.Lívia de Lima Orzil, Ingred Sales Preis, Iassudara Garcia de Almeida, Patrícia Gomes de Souza, Paulo Martins Soares Filho, Fabrício Barcelos JacintoI, Antônio Augusto Fonseca Júnior. Validation of the multiplex PCR for identification of Brucellaspp. Ciência Rural, Santa Maria. 2016; 46(5):847–52. DOI: 10.1590/0103-8478cr20150065.Lívia de Lima Orzil, Ingred Sales Preis, Iassudara Garcia de Almeida, Patrícia Gomes de Souza, Paulo Martins Soares Filho, Fabrício Barcelos JacintoI, Antônio Augusto Fonseca Júnior. Validation of the multiplex PCR for identification of Brucellaspp. Ciência Rural, Santa Maria.2016; 46(5):847–52. DOI: 10.1590/0103-8478cr20150065.Mustafa A.S., Habibi N., Osman A., Shaheed F., Khan M.W. Species identification and molecular typing of human Brucellaisolates from Kuwait. PLoS One. 2017; 12(8):e0182111. DOI: 10.1371/journal.pone.0182111.Mustafa A.S., Habibi N., Osman A., Shaheed F., Khan M.W. Species identification and molecular typing of human Brucellaisolates from Kuwait. PLoS One. 2017; 12(8):e0182111. DOI: 10.1371/journal.pone.0182111.Shevtsova E., Shevtsov A., Mukanov K., Filipenko M., Kamalova D., Sytnik I., Syzdykov M., Kuznetsov A., Akhmetova A., Zharova M., Karibaev T., Tarlykov P., Ramanculov E. Epidemiology of brucellosis and genetic diversity of Brucella abortus in Kazakhstan. PLoS One.2016; 11(12):e0167496. DOI: 10.1371/journal.pone.0167496.Shevtsova E., Shevtsov A., Mukanov K., Filipenko M., Kamalova D., Sytnik I., Syzdykov M., Kuznetsov A., Akhmetova A., Zharova M., Karibaev T., Tarlykov P., Ramanculov E. Epidemiology of brucellosis and genetic diversity of Brucella abortus in Kazakhstan. PLoS One.2016; 11(12):e0167496. DOI: 10.1371/journal.pone.0167496.

The authors declare that there are no conflicts of interest present.