Получение штамма Yersinia pestis, продуцирующего флуоресцентный белок GFP, и перспективы его использования

Цель работы - конструирование рекомбинантного штамма Y. pestis, продуцирующего флуоресцентный белок GFP, и анализ перспектив его использования для изучения взаимодействия возбудителя с простейшими, а также с макроорганизмом млекопитающих (грызунов). Материалы и методы. Для создания штамма, продуцирующего флуоресцентный белок GFP, использовали природный штамм Yersinia pestis, выделенный в 2016 г. в Горно-Алтайском высокогорном очаге чумы. ген флуоресцентного белка был введен в составе коммерческого вектора pTurboGFP-B методом электропорации. Свойства полученного рекомбинантного штамма Y. pestis 367 pTurbo-GFP-B исследовали с помощью микробиологических, биологических и молекулярно-генетических методов. Результаты и обсуждение. Методом электропорации получен штамм возбудителя чумы, содержащий векторную плазмиду pTurboGFP-B, которая кодирует синтез зеленого флуоресцирующего белка GFP, и имеющий устойчивость к антибиотику ампициллину. Сконструированный штамм Y. pestis, продуцирующий зеленый флуоресцентный белок, по своим культурально-морфологическим, биохимическим свойствам, вирулентности и выживаемости в смешанной культуре с акантамебами Acanthamoeba castellani не отличался от исходного. На плотных питательных средах рекомбинантный штамм и его субкультуры, полученные от зараженных животных, формировали колонии желто-зеленого цвета, флуоресцирующие при УФ-облучении. В препаратах, полученных от животных и из со-культур с амебами, наблюдали флуоресцирующие клетки возбудителя чумы. Созданный штамм можно использовать в качестве модельного для изучения в лабораторных условиях взаимоотношений возбудителя чумы с клетками простейших (почвенные амебы, нематоды) и млекопитающих.

1. Онищенко Г.Г., Кутырев В.В., редакторы. Природные очаги чумы Кавказа, Прикаспия, Средней Азии и Сибири. М.: Медицина; 2004. 191 с.

2. Солдаткин И.С., Руденчик Ю.В., Ефимов С.В. Эпизоотический процесс в природных очагах чумы (обзор данных и ревизия концепции). В кн.: Эйгелис Ю.К., редактор. вопросы паразитологии и неспецифической профилактики зоонозов. Саратов; 1988. С. 83-134.

3. Попов Н.В., Слудский А.А., Удовиков А.И., Аникин В.В., Яковлев С.А., Караваева Т.Б. К роли нематод (Secernentea, Rhabdidae) - паразитов блох в энзоотии чумы. Энтомологические и паразитологические исследования в Поволжье. 2006; 5:88-92.

4. Darby C. Uniquely insidious: Yersinia pestis biofilms. Trends Microbiol. 2008; 16(4):158-64. DOI: 10.1016/j.tim.2008.01.005.

5. Hinnebusch B., Erickson D. Yersinia pestis biofilm in the flea vector and its role in the transmission of plague. Curr. Top. Microbiol. Immunol. 2008; 322:229-48. DOI: 10.1007/978-3-540-75418-311.

6. Hall-Stoodley L., Costerton J., Stoodley P. Bacterial bio-films: from the natural environment to infectious diseases. Nat. Rev. Microbiol. 2004; 2(2):95-108. DOI: 10.1038/nrmicro821.

7. Кошель Е.И., Ерошенко Г.А., Анисимова Л.В., Новичкова Л.А., Широков А.А., Буров А.М., Кузнецов О.С., Кутырев В.В. Оценка длительности сохранения штаммов Yersinia pestis в клетках почвенных амеб Acanthamoeba sp. в экспериментальных условиях. Проблемы особо опасных инфекций. 2016; 2:69-74. DOI: 10.21055/0370-1069-2016-2-69-74.

8. Никульшин С. В., Онацкая Т Г., Луканина Л. М. Изучение ассоциации почвенных амеб Hartmannella rhysodes с бактериями - возбудителями чумы и псевдотуберкулеза в эксперименте. Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. 1992; 69(9-10):2-4.

9. Zhang X., Cui Z., Wang D. Sensing of biomolecular interactions using fluorescence complementing systems in living cells. Biosens. Bioelectron. 2016; 76:243-50. DOI: 10.1016/j.bios.2015.07.069.

10. Sarcar P., Chattopadhyay A. GFP fluorescence: A few lesser-known nuggets that make it work. J. Biosci. 2018; 43(3):421-30. DOI: 10.1007/s12038-018-9779-9.

11. Forde C., Rocco J., Fitch J., McCutchen-Maloney S. Real-time characterization of virulence factor expression in Yersinia pestis using a GFP reporter system. Biochem. Biophys. Res. Commun. 2004; 324(2):795-800. DOI: 10.1016/j.bbrc.2004.08.236.

12. Gensberger E., Kostic T. Green fluorescent protein label¬ing of food pathogens Yersinia enterocolitica and Yersinia pseudo-tuberculosis. J. Microbiol. Meth. 2017; 132:21-6. DOI: 10.1016/j.mimet.2016.11.008.

13. Su S., Bangar H., Saldanha R., Pemberton A., Aronow B., Dean G., Lamkin T., Hassett D.J. Construction and characterization of stable, constitutively expressed, chromosomal green and red fluorescent transcriptional fusions in the select agents, Bacillus anthracis, Yersinia pestis, Burkholderia mallei and Burkholderia pseudomallei. MicrobiologyOpen. 2014; 3(5):610-29. DOI: 10.1002/mbo3.192.

14. Shagin D.A., Barsova E.V., Yanushevich Y.G., Fradkov A.F., Lukyanov K.A., Labas Y.A., Semenova T.N., Ugalde J.A., Meyers A., Nunez J.M., Widder E.A., Lukyanov S.A., Matz M.V GFP-like proteins as ubiquitous metazoan superfamily: evolution of functional features and structural complexity. Mol. Biol. Evol. 2004; 21(5):841-50. DOI: 10.1093/molbev/msh079.

15. Conchas R.F., Carniel E. A highly efficient electroporation system for transformation of Yersinia. Gene. 1990; 87(1):133-7. DOI: 10.1016/0378-1119(90)90505-L.

16. Онищенко Г.Г., Кутырев В.В., редакторы. Лабораторная диагностика особо опасных инфекционных болезней. Практическое руководство. М.: ЗАО «Шико»; 2013. 560 с.

17. Kado C., Liu S.-T. Rapid procedure for detection and isolation of large and small plasmids. J. Bacteriol. 1981; 145(3):1365-73. PMID: 7009583. PMCID: PMC217141.

18. Плохинский Н.А. Биометрия. М.: Изд-во МГУ; 1970. 367 с.

19. Балахонов С.В., Афанасьев М.В., Шестопалов М.Ю., Остяк А.С., Витязева С.А., Корзун В.М., Вержуцкий Д.Б., Михайлов Е.П., Мищенко А.И., Денисов А.В., Ивженко Н.И., Рождественский Е.Н., Висков Е.Н., Фомина Л.А. Первый случай выделения Yersinia pestis subsp. pestis в Алтайском горном природном очаге чумы. Сообщение I. Микробиологическая характеристика, молекулярно-генетическая и масс-спектрометрическая идентификация изолята. Проблемы особо опасных инфекций. 2013; 1:60-5. DOI: 10.21055/0370-1069-2013-1-60-65.