Приведены данные по международному сотрудничеству Республиканского центра карантинных и особо опасных инфекций Министерства здравоохранения Кыргызской Республики и Российского противочумного института «Микроб» Роспотребнадзора по борьбе с чумой и другими опасными инфекциями за период с 2016 по 2022 год. Направления сотрудничества включают: проведение совместного эпизоотологического мониторинга очагов чумы Кыргызской Республики (КР); обмен актуальной информацией по состоянию природных очагов двух стран; оснащение противочумной службы республики современным оборудованием и мобильными лабораториями, диагностическими средствами и технологиями; проведение совместных учений по обеспечению биологической безопасности и оперативному реагированию на чрезвычайные ситуации; оказание консультативнометодической помощи; обучение и усовершенствование профессиональных кадров; проведение совместных научных исследований, конференций; опубликование статей. Обобщены данные по комплексной характеристике свойств и филогеографическому анализу штаммов Yersinia pestis, выделенных в полевых исследованиях в КР в 2012–2020 гг. Намечены перспективы проведения совместных картографических, молекулярно-генетических и палеомикробиологических работ в природных очагах КР.

В обзоре представлены данные по отечественным и зарубежным фенотипическим классификациям штаммов Yersinia pestis, разработанным в XX в.; генетическим классификациям XXI в.; а также по генеалогии древних штаммов чумного микроба, реконструированной с помощью палеогеномных технологий. С момента открытия возбудителя чумы в 1894 г. были созданы многие классификации, которые соответствовали уровню развития микробиологии на тот период времени. В основу внутривидовых классификационных схем XX в. положены три принципа: фенотипические различия между штаммами, особенности видового состава носителей и географическая принадлежность. С развитием молекулярной микробиологии в начале XXI в. разработана генетическая номенклатура ветвей эволюции возбудителя и создан ряд классификаций, построенных на анализе популяционной структуры Y. pestis. Через призму генетического разнообразия штаммов Y. pestis из природных очагов чумы России, стран ближнего и дальнего зарубежья разработана усовершенствованная классификация с выделением семи подвидов: pestis, tibetica, caucasica, qinghaica, angolica, central asiatica, ulegeica, – которая разделила подвиды по филогенетическому принципу и по эпидемической значимости. С развитием палеомикробиологии в генеалогию Y. pestis включены доисторические линии эволюции, которые расширили сведения по внутривидовому разнообразию чумного микроба.

Изучение свежевыделенных культур необходимо для составления объективного представления об особенностях свойств природных популяций чумного микроба. Проведен анализ уровней изучения свойств штаммов и представлена характеристика Yersinia pestis в Казахстане. Приведены результаты изучения фенотипических и генетических свойств природных штаммов чумного микроба. В результате эпизоотологического обследования природных очагов чумы ежегодно в музеи живых культур противочумных станций поступают штаммы возбудителя чумы, которые передаются в Национальную коллекцию микроорганизмов ННЦООИ . Одним из главных моментов является определение типичности/атипичности штаммов Y. pestis. Изучение штаммов начинается в момент выделения в противоэпидемических отрядах. Первичная идентификация штаммов проводится в лабораториях эпидотрядов по морфологии, чувствительности к чумным и псевдотуберкулезному бактериофагам, ферментации глицерина, рамнозы и сахарозы. В лабораториях станций и отделений дополнительно исследуются: ферментация мальтозы и арабинозы, денитрификация, потребности в аминокислотах, вирулентность, чувствительность к антибиотикам. При изучении вирулентности штаммов изучаются: кальцийзависимость, наличие и количество F1, пестициногенность и чувствительность к пестицину 1 и вирулентность для белых мышей. Изучение и сохранение собранного генофонда в Национальной коллекции ННЦООИ включает различные направления работы, одним из главных является углубленное исследование по всем признакам стандартными микробиологическими методами, молекулярными методами для полной идентификации и создания банка данных, содержащего информацию о геноме штаммов при разной интенсивности эпизоотического процесса. В ННЦООИ имеется компьютеризованная база данных по учету и движению штаммов, оборудование для молекулярных исследований. В коллекции проводится оценка свойств, систематизируются сведения и обеспечивается жизнеспособность штаммов возбудителя чумы с целью долгосрочного хранения.

В обзоре представлен анализ литературных данных, посвященных применению разнообразных современных молекулярно-генетических методов для проведения индикации и идентификации штаммов Yersinia pestis, обладающих разными свойствами и степенью вирулентности, что обусловлено разнообразными природными условиями, в которых они циркулируют. Методы рассмотрены и с позиции перспективности их применения на трех уровнях (территориальном, региональном и федеральном) системы лабораторной диагностики инфекционных болезней в организациях Роспотребнадзора, для решения задачи поддержания санитарно-эпидемиологического благополучия населения страны. Рассмотрены основные группы методов: основанные на анализе длин рестрикционных фрагментов (рибо- и IS-типирование, пульс-гельэлектрофорез); основанные на анализе специфических фрагментов (DFR-типирование, VNTR-типирование); основанные на секвенировании (MLST, CRISPR-анализ, SNP-анализ); ПЦР -методы (включая IPCR, SPA); методы изотермической амплификации (LAMP, HDA, RPA, SEA, PCA, SHERLOCK); ДНК‑ чипы; методы, использующие технологию аптамеров; био- и наносенсоры; ДНК - оригами; методы на основе нейронных сетей. В результате проведенного анализа можно сделать вывод о стремительном развитии молекулярной диагностики и генетики, которое направлено на повышение оперативности, многофакторности и упрощение применения с отсутствием необходимости в дорогостоящем оборудовании и высококвалифицированных кадрах для проведения анализа. На всех уровнях системы лабораторной диагностики инфекционных болезней в организациях Ропотребнадзора возможно использование методов, основанных на ПЦР, изотермической амплификации, SHERLOCK, биосенсорах, малогабаритных приборах для секвенирования. На территориальном уровне в противочумных станциях перспективным является использование иммуно‑ПЦР и SPA для проведения индикации Y. pestis. На региональном уровне многообещающим выглядит внедрение технологий, основанных на использовании аптамеров и ДНК‑ чипах. Для федерального уровня перспективно применение методов ДНК -оригами и новых технологий полногеномного секвенирования в рамках выполнения расширенной идентификации, молекулярного типирования и секвенирования геномов штаммов возбудителя чумы.

Метод SNP-типирования, основанный на выявлении в геноме стабильных генетических маркеров – однонуклеотидных полиморфизмов, успешно применяется для генотипирования патогенных микроорганизмов и может быть использован для SNP-профилирования штаммов Yersinia pestis и проведения молекулярно-генетической паспортизации очаговых территорий. Цель работы – определение SNP-профилей штаммов Y. pestis средневекового биовара, выделенных в очагах чумы Прикаспия в 1912–2015 гг., и разработка способа идентификации уникальных SNPs методом секвенирования по Сэнгеру для проведения молекулярно-генетической паспортизации этих территорий. Материалы и методы. Проведено комплексное исследование фенотипических и генотипических свойств 190 штаммов Y. pestis из очагов чумы Прикаспийского региона. Филогенетическая реконструкция методом максимального правдоподобия (Maximum Likelihood, модель GTR) в программе SeaView 5.0.4 выполнена на основе 1621 SNPs, идентифицированных среди 50 штаммов Y. pestis по данным WG-SNP-анализа в программе snippy 4.6. Расчет праймеров для ПЦР -амплификации отобранных в кандидаты-мишени SNP-локусов проводили в программе Vector NTI. Секвенирование локусов SNPs по Сэнгеру осуществлялось на генетическом анализаторе ABI PRISM 3500XL (Applied Biosystems, США). Результаты и обсуждение. Все исследованные штаммы из очагов Прикаспия по фенотипическим характеристикам относились к высоковирулентному и эпидемически значимому средневековому биовару основного подвида Y. pestis. По результатам WG-SNP-анализа определено 9 SNP-генотипов, основанных на полиморфизме единичных нуклеотидов 24 генов, характерных для ключевых филопопуляций, в которые входят штаммы, выделенные в различные периоды эпидемической и эпизоотической активности в очагах Прикаспия. Установление SNP-генотипов штаммов средневекового биовара Y. pestis, полученных более чем за столетний период в очагах Прикаспийского региона, создает предпосылки для определения их канонического SNP-профиля (canSNP) и для разработки алгоритма молекулярно-эпидемиологического мониторинга очагов, в которых циркулирует этот высоковирулентный биовар.

Конструирование новых средств специфической профилактики чумы, тем более субъединичных вакцин, невозможно без исследования роли отдельных антигенов в проявлении патогенных и иммуногенных свойств Yersinia pestis. Цель настоящего исследования состояла в определении методом иммуноферментного анализа (ИФА) уровня антител к антигенам чумного микроба в сыворотках морских свинок, выживших после заражения сублетальными дозами вирулентных штаммов чумного микроба. Материалы и методы. Морских свинок заражали подкожно штаммом дикого типа Y. pestis subsp. pestis 231 или бескапсульным (Caf1–) штаммом Y. Pestis subsp. pestis 358/12 в дозе 30 КОЕ . Кровь от больных или переболевших чумой морских свинок отбирали на 15, 30, 60 и 90-е сутки после заражения. Антительный ответ определяли к 18 рекомбинантным белкам Y. pestis методом ИФА. Результаты и обсуждение. У морских свинок наблюдали неоднородный антительный ответ к большинству антигенов с вариацией титров IgG от животного к животному. После введения штаммов Y. pestis 231 и Y. pestis 358/12 иммунодоминантный характер имели 6 (AilC, Caf1, Pla, YapM, YapL, TalB) и 6 (AilC, pH6, SurA, YapM, MetQ, HtpG) из 18 использованных белков соответственно. Для большинства исследуемых антигенов наблюдали подъем титров антител в сыворотках морских свинок, зараженных штаммом дикого типа Y. pestis 231, к 90-м суткам наблюдения, в то время как при заражении бескапсульным (Caf1–) штаммом Y. pestis subsp. Pestis 358/12 обнаружили тенденцию снижения титров специфических антител к 90-м суткам. Сохранение в организме морских свинок в течение длительного времени после перенесенного заболевания антител к белкам Y. pestis разной локализации, функциональной активности, степени представленности на поверхности бактериальной клетки свидетельствует о множественном характере формирования иммунного ответа при чуме. Полученные результаты важны для дизайна эффективных вакцин против чумы, а также для поиска новых мишеней для диагностики данной инфекции.

Цель работы – сравнение нуклеотидных последовательностей генов pgm‑области штаммов Yersinia pestis, выделенных в 1925–2015 гг. на территории Прикаспийского песчаного и сопредельных очагов чумы. Материалы и методы. В работе использованы 65 штаммов Y. pestis из Прикаспийского песчаного и сопредельных очагов чумы. Выделение ДНК проводили с помощью набора PureLink Genomic DNA Mini Kit. Полногеномное секвенирование выполняли в Ion S5 XL System (Thermo Fischer Scientific). Обработку данных осуществляли с помощью Ion Torrent Suite software package 3.4.2 и NewblerGS Assembler 2.6. Для сравнения полученных последовательностей с генетическим банком данных GenBank NCBI использовали алгоритм Blast. Филогенетический анализ выполнен по данным полногеномного SNP‑анализа на основе 1183 выявленных SNPs. Поиск маркерных SNPs выполняли с помощью программы Snippy 4.6. Построение филогенетического дерева осуществляли с использованием алгоритма Maximum Likelihood, модель нуклеотидных замен GTR. Результаты и обсуждение. Проанализированы нуклеотидные последовательности генов pgm‑области 65 штаммов Y. pestis из Прикаспийского песчаного и сопредельных очагов чумы. Выявлены единичные нуклеотидные замены у штаммов Y. pestis из Прикаспийского песчаного и Кобыстанского равнинно-предгорного очагов в генах hmsR, astВ, ybtS, ypo1944, ypo1943, ypo1936, а также делеция в 5 п.н. в гене ypo1945, которая характерна для штаммов одной из филогенетических линий Y. pestis из очагов Кавказа и Закавказья, выделенных в 1968–2001 гг. Полученные данные могут быть использованы для дифференциации штаммов Y. pestis из Прикаспийского песчаного очага, а также в установлении направлений микроэволюции возбудителя чумы в этом регионе Прикаспия и сопредельных очагах.

Особенностью эпидемического процесса последних лет является зависимость заболеваемости различными нозологиями от эпидемической ситуации в соседних странах. В связи с этим особую важность приобретает проведение совместных противоэпидемических и профилактических мероприятий в приграничных районах с целью предупреждения завоза опасных инфекций на территории сопредельных государств. Цель работы – анализ результатов международного сотрудничества в профилактике особо опасных инфекций. Представлены направления сотрудничества и результаты совместных исследований. Описаны мероприятия по сотрудничеству между профильными учреждениями Министерства здравоохранения Республики Казахстан и Роспотребнадзора в области оперативного обмена информацией при возникновении чрезвычайных ситуаций, проведения совместных исследовательских работ по мониторингу особо опасных и других природно-очаговых инфекционных болезней на приграничных территориях, совместных семинаров, научно-практических конференций по внедрению в практику современных методов лабораторной диагностики, стажировок по обмену опытом по методам эпизоотологического обследования в очагах особо опасных инфекций. Описаны примеры российско-казахстанского сотрудничества. Представлены результаты совместного с Российской Федерацией эпизоотологического обследования территории казахстанской части горного Алтая. В глобальном масштабе случаи заболевания чумой и другими особо опасными инфекциями в любом географическом регионе могут представлять собой международные чрезвычайные ситуации в области общественного здравоохранения, и этот тип угрозы требует международного сотрудничества.

Цель работы – предложить методические приемы прямого количественного определения специфических белковых антигенов Yersinia pestis и Rickettsia raoultii в препаратах и различных прототипах субъединичных вакцин. Материалы и методы. В качестве модельных использовали антигены Y. pestis LcrV и Caf1, заключенные в субстанцию вакцины чумной молекулярной микроинкапсулированной (ВЧММ ) и раздельно, в микрокристаллы аминокислот, соосажденных с белками чумного микроба. Антигены R. raoultii Adr2, OmpB24, YbgF адсорбировали прототипом субстанции риккетсиозной вакцины. Освобождение чумных антигенов из микрокапсул ВЧММ проводили последовательной обработкой последних органическими растворителями метиленхлоридом и метанолом соответственно, микрокристаллы-носители растворяли 0,1 М натрий-цитратным буфером, рН 6,0. Антигены в прототипе субстанции риккетсиозной вакцины определяли измерением количества белков, не связывающихся с алюмогелем. Количественные параметры, характеризующие содержание антигенов в субстанциях и прототипах вакцинных препаратов, вычисляли в результате обработки цифровых изображений полиакриламидных гелей, полученных электрофорезом фракций белковых антигенов, экстрагированных из носителей. Результаты и обсуждение. Изучены не вызывающие деградацию белка способы прямой экстракции и последующего количественного анализа антигенов Y. pestis LcrV и Caf1 из препаратов субъединичных вакцин на основе микрокристаллов аминокислот и полилактидных микрокапсул. Установлен различный характер связывания LcrV и Caf1 в субстанциях микрокристаллов, при этом количественно определена доля антигенов, освобождающихся из микрокристаллов только в результате их полного растворения. Выявлено, что при низких концентрациях белков LcrV и Caf1, экстрагированных из микрокристаллов, для их уверенной визуализации необходимо концентрирование экстрактов с последующим удалением солей. Подтверждено, что 10 мкг чумных антигенов и белков R. raoultii в объеме дозы введения 200 мкл суспензии достаточно для количественного анализа электрофоретическим методом. Обсуждаются перспективы альтернативных прямой экстракции антигенов иных физико-химических методов оценки состава и качества вакцинных препаратов.

Патогенные бактерии используют низкомолекулярные хелаторы железа – сидерофоры – для ассимиляции железа в организме хозяина. Будучи признанными факторами вирулентности, эти молекулы, различающиеся по структурным и функциональным свойствам, являются предметом наиболее интенсивного изучения в медицинской микробиологии. Настоящее исследование посвящено изучению сидерофора иерсиниахелина (Ych), обнаруженного у возбудителя чумы Yersinia pestis. Цель работы – выяснение роли Ych в физиологии Y. pestis путем сравнения свойств трех штаммов чумного микроба, различающихся по продукции Ych. Материалы и методы. В экспериментах использованы три варианта штамма Y. pestis EV76: родительский штамм Y. pestis EV76, его мутант, не продуцирующий Ych из-за делеции трех генов биосинтеза сидерофора (аналоги ypo1530–1532 в штамме Y. Pestis СО 92), и комплементированный мутант, который трансформирован рекомбинантной плазмидой pSC-A-5EV, содержащей клонированные гены биосинтеза Ych в составе высококопийного плазмидного вектора pSC-A-amp/kan. Сравнительный анализ трех штаммов проведен по морфологии колоний, сидерофорной активности, скорости роста и чувствительности к перекиси водорода. Результаты и обсуждение. В результате сравнения штаммов установлено, что секреция бактериями Ych при 26 °С обеспечивает ассимиляцию бактериями железа. При 37 °С Ych не секретируется в среду и обеспечивает защиту бактерий от бактерицидного действия реактивных соединений кислорода. Таким образом, в ходе исследования показано, что иерсиниахелин способен стимулировать ассимиляцию бактериями железа в железодефицитных условиях и обладает антиоксидантными свойствами.

Цель исследования – выявление возможности длительного выживания и сохранения свойств Yersinia pestis в ассоциации с почвенными амебами Acanthamoeba castellanii. Материалы и методы. Использовали штаммы возбудителя чумы и акантамеб, выделенные на одном участке Горно-Алтайского высокогорного очага чумы. Систематическую принадлежность простейших определяли путем анализа данных секвенирования фрагмента гена 18S рРНК с последующим выравниванием на последовательности амеб из базы данных NCBI GenBank. Получение флуоресцентного штамма Y. pestis осуществляли методом электропорации с использованием плазмиды pTurboGFP-B. Совместное культивирование проводили в солевом буфере в отсутствие питательных веществ для клеток возбудителя чумы. Определение влияния сокультивирования с простейшими на свойства штамма Y. Pestis выполняли с помощью микробиологических, биологических и молекулярно-генетических методов. Результаты и обсуждение. Установлено сохранение жизнеспособности клеток штамма Y. pestis основного подвида античного биовара филогенетической линии 4.ANT в совместной культуре с клетками амеб в отсутствие дополнительных питательных веществ на протяжении 22 месяцев эксперимента. Сокультивирование с амебами не привело к изменению культурально-морфологических, генетических и вирулентных свойств штамма возбудителя чумы. Полученные данные подтверждают возможность использования Acanthamoeba castellanii чумным микробом для персистенции в почвенных биоценозах и открывают перспективу изучения механизмов сохранения возбудителя чумы в течение длительных межэпизоотических периодов.

Целью работы является оценка современного эпизоотического потенциала Закавказского высокогорного и Приараксинского низкогорного природных очагов чумы на территории Республики Армения с применением ГИС -технологий. Материалы и методы. В работе использованы данные эпизоотологического обследования, учетов численности и видового состава, пространственного распределения грызунов и эктопаразитов на энзоотичных по чуме территориях Республики Армения в 2021 г. Результаты и обсуждение. По результатам исследований создана электронная база данных носителей и переносчиков возбудителей природно-очаговых зоонозных инфекций на энзоотичных по чуме территориях Республики Армения. С применением ГИС -технологий выполнена оценка пространственного распределения носителей и переносчиков чумы, выявлены участки циркуляции возбудителей туляремии и лептоспирозов. Полученные результаты служат основой повышения эффективности планирования и проведения профилактических мероприятий, направленных на обеспечение эпидемиологического благополучия по природно-очаговым инфекционным болезням на территории Республики Армения.

Предполагается, что энтомопаразитические нематоды блох являются связующим звеном между частями популяции Yersinia pestis во внешней среде и в блохе-переносчике. Цель исследования – анализ экстенсивности и интенсивности нематодной инвазии у блох длиннохвостого суслика на территории Монгун-Тайгинского стационара в Тувинском природном очаге чумы. Материалы и методы. Блох собирали в процессе плановых эпизоотологических обследований в 2019–2021 гг. При проведении таксономической идентификации регистрировали наличие паразитических нематод. Для оценки интенсивности нематодной инвазии вскрыто 190 блох. Фиксировали количество взрослых паразитирующих самок нематод и наличие личинок. Статистическую обработку данных провели общепринятыми методами с применением программы Excel. Использовали критерий χ2, влияние двух факторов (вид, пол блох) на изучаемые показатели оценивали с помощью одно- и двухфакторного дисперсионного анализа. Результаты и обсуждение. За три года наблюдений энтомопаразитические нематоды обнаружены в блохах шести видов: Citellophilus tesquorum, Frontopsylla elatoides, Rhadinopsylla li transbaikalica, Frontopsylla hetera, Oropsylla alaskensis, Neopsylla mana. Показаны видовые различия блох в зараженности нематодами. Наивысшая инвазированность – 25,1–25,6 % – отмечена у Rh. li transbaikalica. Половая принадлежность блох не влияла на их зараженность. Установлено, что зараженные блохи чаще находятся в гнезде, чем в шерсти прокормителя, и менее активно, чем незараженные эктопаразиты, мигрируют ко входам нор. По результатам оценки интенсивности инвазии блохи Rh. li transbaikalica являются хозяевами нематод моно- или олигоксенного вида, который не встречается у других блох.

Цель исследования – разработка нового способа внутривидовой генетической дифференциации Yersinia pseudotuberculosis, основанного на выявлении INDEL-маркеров с помощью ПЦР . Материалы и методы. Проведен анализ 308 штаммов из базы данных NCBI и 15 штаммов, секвенированных в настоящем исследовании. Определение нуклеотидных последовательностей штаммов осуществили при использовании технологической платформы MiSeq. Анализ геномов секвенированных штаммов, а также геномов из базы данных NCBI выполнили с помощью ПЦР in silico с 7 парами сконструированных праймеров. Результаты и обсуждение. В результате сравнения с помощью авторского программного обеспечения (GenExpert) полногеномных последовательностей 22 штаммов Y. pseudotuberculosis из базы данных NCBI отобрано 7 INDEL-маркеров, позволяющих эффективно различать штаммы возбудителя псевдотуберкулеза. На основе этих маркеров сконструированы и синтезированы 7 пар праймеров для анализа разных штаммов с помощью ПЦР . Анализ 323 штаммов в ПЦР in silico и 70 штаммов в ПЦР in vitro позволил разделить их на 30 генетических групп. Сопоставление результатов ПЦР in silico и in vitro подтвердило возможность использования предложенных праймеров для внутривидовой дифференциации Y. pseudotuberculosis. На основе полученных данных построена дендрограмма, отражающая филогенетические связи разных штаммов Y. pseudotuberculosis. Выявлен ряд закономерностей при анализе распределения штаммов Y. pseudotuberculosis по различным кластерам и генетическим группам. Показано, что предложенный способ INDEL-типирования может быть использован для внутривидовой генетической дифференциации возбудителя псевдотуберкулеза.

Для осуществления эпидемиологического надзора за чумой в Сайлюгемском природном очаге совместно с монгольскими специалистами внедрены и применяются современные молекулярно-генетические методы диагностики и типирования Yersinia pestis ssp. pestis в полевом и клиническом материале. Цель работы – изучить пространственную генотипическую структуру Y. pestis ssp. pestis в трансграничном Сайлюгемском природном очаге чумы методом MLVA25‑типирования. Материалы и методы. Проведено MLVA25‑типирование 160 штаммов Y. pestis ssp. pestis, изолированных в Сайлюгемском природном очаге чумы в 2012–2021 гг. Построение филогенетического древа осуществляли методами UPGMA и MST. Результаты и обсуждение. На основе кластерного анализа 25 VNTR-локусов штаммы Y. pestis ssp. pestis, изолированные в трансграничном Сайлюгемском природном очаге чумы, дифференцированы на 15 MLVA‑типов. Установлено, что исследуемые штаммы образуют однородный комплекс MLVA25‑типов без выраженной географической структурированности их по семи пространственным группам. При анализе частоты встречаемости числа тандемных повторов по трем вариабельным локусам у штаммов Y. pestis ssp. pestis выявлено, что между выборками из монгольской и российской частей очага наблюдаются значимые различия. Наиболее выраженные различия пространственной генотипической структуры прослеживаются по локусу yp4280ms62.