Оценка эффективности детекции генетических детерминант Vibrio cholerae в системе мониторинга вибриофлоры водных объектов

Цель – оценка эффективности применения ПЦР-скрининга генетических детерминант Vibrio cholerae в пробах из поверхностных водоемов для оптимизации системы микробиологического мониторинга холеры.

Материалы и методы. Исследование проводилось в рамках мониторинга вибриофлоры поверхностных водоемов Иркутска. Дизайн исследования предусматривал: 1) ПЦР-скрининг генетических детерминант V. cholerae в обогащенных на питательных средах (1 % пептонная вода) пробах из поверхностных водоемов в период мониторинга (824 пробы); 2) изучение динамики накопления ДНК V. cholerae при исследовании в ПЦР проб из поверхностных водоемов в процессе культивирования на средах обогащения (16 проб в динамике); 3) экспериментальное исследование детектируемых концентраций холерного вибриона в пробах из поверхностных водоемов. Проводилась индикация видоспецифических (hlyA, toxR) и серогруппоспецифических (wbeT, wbfR) детерминант V. cholerae в ПЦР c гибридизационно-флуоресцентной и электрофоретической детекцией.

Результаты и обсуждение. На первом этапе установлено, что удельный вес положительных по результатам ПЦР-скрининга проб (33,9 %) превысил процент положительных проб при бактериологическом исследовании (19,3 %) (t=6,6; p<0,01). При оценке динамики накопления ДНК зарегистрировано снижение порогового цикла (Ct) в 1,2–5,2 раза, свидетельствующее о нарастании концентрации холерного вибриона и доказывающее выявление при ПЦР-скрининге генетических детерминант жизнеспособных форм микроорганизма. Расширенное исследование ПЦР-положительных бактериологически отрицательных проб позволило дополнительно выделить четыре культуры V. cholerae. Однако в эксперименте с искусственно контаминированными холерным вибрионом образцами воды, в отличие от анализа обогащенных нативных проб, не выявлено различий чувствительности ПЦР-скрининга и бактериологического анализа, что может быть обусловлено особенностями метаболизма и адаптации микроорганизма в разных условиях среды. Результаты комплексного исследования свидетельствуют об эпидемиологической эффективности ПЦР-скрининга, что дает основание рекомендовать его применение в лабораториях федерального, регионального и территориального уровней при мониторинговых исследованиях вибриофлоры проб из объектов окружающей среды после их предварительного обогащения на жидких питательных средах.

1. Онищенко Г.Г., Марамович А.С., Голубинский Е.П., Маслов Д.В., Вершкова Т.И., Урбанович Л.Я., Алленов А.В., Мурначев Г.П., Гарковенко Л.Е., Воронок В.М. Холера на Дальнем Востоке России. Сообщение 1. Эпидемиологическая характеристика вспышки холеры Эль Тор в г. Владивосток. Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. 2000; 5:26–31.

2. Онищенко Г.Г., Марамович А.С., Голубинский Е.П., Папиренко Е.В., Ганин В.С., Бурый В.Л., Морозова И.В., Мартынова Т.М. Холера на Дальнем Востоке России. Сообщение 2. Эпидемиологическая характеристика вспышки холеры Эль Тор в г. Южно-Сахалинск. Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. 2000; 5:31–5.

3. Онищенко Г.Г., Ломов Ю.М., Мишанькин Б.Н., Мазрухо Б.Л., Подосинникова Л.С., Кудрякова Т.А., Москвитина Э.А., Водопьянов С.О., Рыжко И.В., Казакова Е.С., Шарова И.Н., Плотникова Е.А., Давыдова Н.А., Абрамова Е.Г., Королев Ю.С., Шестиалтынова И.С., Шарифулина Д.М., Куряева Н.Ю., Юмангулова Е.Ф., Чернышева А.В., Бугоркова Т.В., Русакова Т.Г., Масленикова А.Л., Милова М.В., Захарова Л.И., Билалов Т.Г., Шутько А.Г., Качкина Г.В. Характеристика холерных вибрионов Эль Тор, выделенных в г. Казань в 2001 г. Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. 2002; 2:3–6.

4. Ратникова Л.И., Кузьмина Н.Я. Случай холеры в Челябинске. Эпидемиология и инфекционные болезни. 2002; 2:53–4.

5. Онищенко Г.Г., Ломов Ю.М., Москвитина Э.А., Подосинникова Л.С., Водяницкая С.Ю., Прометной В.И., Монахова Е.В., Водопьянов C.O., Телесманич Н.Р., Дудина Н.А. Холера, обусловленная V. cholerae O1 ctxАВ-tcpA+. Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. 2007; 1:23–9.

6. Luo Y., Octavia S., Jin D., Ye J., Miao Z., Jiang T., Xia S., Lan R. US Gulf-like toxigenic O1 Vibrio cholerae causing sporadic cholera outbreaks in China. J. Infect. 2016; 72(5):564–72. DOI: 10.1016/j.jinf.2016.02.005.

7. Wang H., Yang C., Sun Z., Zheng W., Zhang W., Yu H., Wu Y., Didelot X., Yang R., Pan J., Cui Y. Genomic epidemiology of Vibrio cholerae reveals the regional and global spread of two epidemic nontoxigenic lineages. PLoS Negl. Trop. Dis. 2020; 14(2):e0008046. DOI: 10.1371/journal.pntd.0008046.

8. Монахова Е.В., Архангельская И.В. Холерные вибрионы неО1/неО139 серогрупп в этиологии острых кишечных инфекций: современная ситуация в России и в мире. Проблемы особо опасных инфекций. 2016; 2:14–23. DOI: 10.21055/0370-1069-2016-2-14-23.

9. Кругликов В.Д., Левченко Д.А., Титова С.В., Москвитина Э.А., Архангельская И.В., Гаевская Н.Е., Ежова М.И. Холерные вибрионы в водоемах Российской Федерации. Гигиена и санитария. 2019; 98(4):393–9. DOI: 10.18821/0016-9900-2019-98-4-393-399.

10. Онищенко Г.Г., Попова А.Ю., Кутырев В.В., Смирнова Н.И., Щербакова С.А., Москвитина Э.А., Титова С.В. Актуальные проблемы эпидемиологического надзора, лабораторной диагностики и профилактики холеры в Российской Федерации. Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. 2016; 1:89–101. DOI: 10.36233/0372-9311-2016-1-89-101.

11. Шарова И.Н., Казакова Е.С., Портенко С.А., Красовская Т.Ю., Осина Н.А., Куклев В.Е., Карнаухов И.Г., Щербакова С.А., Топорков А.В., Чеснокова М.В., Куличенко А.Н., Кутырев В.В. Совершенствование и стандартизация лабораторной диагностики особо опасных, «новых» и «возвращающихся» инфекционных болезней. Проблемы особо опасных инфекций. 2013; 2:46–8. DOI: 10.21055/0370-1069-2013-2-46-48.

12. Онищенко Г.Г., Ежлова Е.Б., Демина Ю.В., Мельникова А.А. О мерах по совершенствованию эпидемиологического надзора в части индикации возбудителей инфекционных заболеваний. Эпидемиология и инфекционные болезни. Актуальные вопросы. 2013; 2:4–13.

13. Ramamurthy T., Das B., Chakraborty S., Mukhopadhyay A.K., Sack D.A. Diagnostic techniques for rapid detection of Vibrio cholerae O1/O139. Vaccine. 2020; 38(1):A73–A82. DOI: 10.1016/j.vaccine.2019.07.099.

14. Миронова Л.В., Басов Е.А., Афанасьев М.В., Хунхеева Ж.Ю., Миткеева С.К., Ганин В.С., Урбанович Л.Я., Куликалова Е.С., Гольдапель Э.Г., Балахонов С.В. MALDI-ToF массспектрометрический анализ с молекулярно-генетической идентификацией Vibrio spp. в системе мониторинга вибриофлоры поверхностных водоемов. Эпидемиология и инфекционные болезни. 2014; 19(6):27–36. DOI: 10.17816/EID40838.

15. Brenzinger S., van der Aart L.T., van Wezel G.P., Lacroix J.M., Glatter T., Briegel A. Structural and proteomic changes in viable but non-culturable Vibrio cholerae. Front Microbiol. 2019; 10:793. DOI: 10.3389/fmicb.2019.00793.

16. Jubair M., Morris J.G. Jr., Ali A. Survival of Vibrio cholerae in nutrient-poor environments is associated with a novel “persister” phenotype. PLoS One. 2012; 7(9):e45187. DOI: 10.1371/journal.pone.0045187.

17. Conner J.G., Teschler J.K., Jones C.J., Yildiz F.H. Staying alive: Vibrio cholerae’s cycle of environmental survival, transmission, and dissemination. Microbiol. Spectr. 2016; 4(2):10.1128/microbiolspec.VMBF-0015-2015. DOI: 10.1128/microbiolspec.VMBF-0015-2015.

18. Романова Ю.М., Алексеева Н.В., Гинцбург А.Л. Некультивируемое состояние у патогенных бактерий на модели Salmonela typhimurium: феномен и генетический контроль. Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. 1997; 4:35–41.

19. Lutz C., Erken M., Noorian P., Sun S., McDougald D. Environmental reservoirs and mechanisms of persistence of Vibrio cholerae. Front. Microbiol. 2013; 4:375. DOI: 10.3389/fmicb.2013.00375.

20. Меньшикова Е.А., Архангельская И.В., Левченко Д.А., Курбатова Е.М., Кругликов В.Д., Титова С.В. Влияние температурных флуктуаций воды поверхностных водоемов города Ростова-на-Дону на циркуляцию холерных вибрионов. Вестник биотехнологии и физико-химической биологии им. Ю.А. Овчинникова. 2018; 14(4):14–20.