Выделение гликопротеина вируса бешенства методом трехфазной экстракции и характеристика его антигенных свойств

Цель работы – разработка методического подхода к выделению гликопротеина вируса бешенства с использованием трехфазной экстракции и характеристика его антигенных свойств.

Материалы и методы. Инфекционную активность вируса бешенства (производственный штамм «Овечий» ГНКИ) после длительного хранения восстанавливали на белых мышах линии BALB/c. Штамм использовали для культивирования на клетках линии ВНК-21; культуральную жидкость концентрировали методом ультрацентрифугирования с последующим разделением ее по плавучей плотности в градиенте сахарозы, отбором визуально опалесцирующих зон, фазовым концентрированием, хроматографическим разделением на колонке ENrich™ SEC650 (Bio-Rad, США) и отбором мономерных фракций с высокой серологической активностью по результатам вестерн-блоттинга.

Результаты и обсуждение. Показано, что предварительное механическое разрушение суспензии головного мозга, извлечение вируссодержащего материала из клеточной суспензии путем последовательных этапов центрифугирования, разделение осадка, полученного в градиенте сахарозы, c дальнейшей очисткой фазовым концентрированием и хроматографическим разделением преципитата позволяет получать мономерный препарат с высокой серологической активностью. Данный подход позволил получить антиген, представляющий собой гликопротеин вируса бешенства с молекулярной массой 67 кДа и две его изоформы с молекулярной массой 60 и 54 кДа. Описанный подход можно рассматривать в качестве варианта выделения специфического антигена вируса бешенства при проведении работ по совершенствованию методов лабораторной диагностики. Полученный антиген является мономерным дискретом и содержит одну фракцию молекулярной массой 67 кДа. Результаты исследований подтверждают высокую специфичность антигена и его пригодность для конструирования иммуноферментных и иммунохроматографических тестов, получения специфических иммуноглобулинов, рецепторного изучения взаимодействия антиген/антитело, а также для оценки напряженности протективного иммунитета после вакцинации.

1. Fooks A.R., Shipley R., Markotter W., Tordo N., Freuling C.M., Müller T., McElhinney L.M., Banyard A.C., Rupprecht C.E. Renewed public health threat from emerging lyssaviruses. Viruses. 2021; 13(9):1769. DOI: 10.3390/v13091769.

2. Elmgren L.D., Nadin-Davis S.A., Muldoon F.T., Wandeler A.I. Diagnosis and analysis of a recent case of human rabies in Canada. Can. J. Infect. Dis. 2002; 13(2):129–33. DOI: 10.1155/2002/235073.

3. Saengseesom W., Mitmoonpitak C., Kasempimolporn S., Sitprija V. Real-time PCR analysis of dog cerebrospinal fluid and saliva samples for ante-mortem diagnosis of rabies. Southeast Asian J. Trop. Med. Public Health. 2007; 38(1):53–7.

4. Shulpin M.I., Nazarov N.A., Chupin S.A., Korennoy F.I., Metlin A.Ye., Mischenko A.V. Rabies surveillance in the Russian Federation. Rev. Sci. Tech. 2018; 37(2):483–95. DOI: 10.20506/rst.37.2.2817.

5. Hicks D.J., Fooks A.R., Johnson N. Developments in rabies vaccines. Clin. Exp. Immunol. 2012; 169(3):199–204. DOI: 10.1111/j.1365-2249.2012.04592.x.

6. Mani R.S., Madhusudana S.N. Laboratory diagnosis of hu- man rabies: recent advances. Sci. World J. 2013; 2013:569712. DOI: 10.1155/2013/569712.

7. Fontana D., Kratje R., Etcheverrigaray M., Prieto C. Rabies virus-like particles expressed in HEK293 cells. Vaccine. 2014; 32(24):2799–804. DOI: 10.1016/j.vaccine.2014.02.031.

8. Kang H., Qi Y., Wang H., Zheng X., Gao Y., Li N., Yang S., Xia X. Chimeric rabies virus-like particles containing membrane-an- chored GM-CSF enhances the immune response against rabies virus. Viruses. 2015; 7(3):1134–52. DOI: 10.3390/v7031134.

9. Gaudin Y., Ruigrok R.W., Tuffereau C., Knossow M., Flamand A. Rabies virus glycoprotein is a trimer. Virology. 1992; 187(2):627–32. DOI: 10.1016/0042-6822(92)90465-2.

10. Morimoto K., Foley H.D., McGettigan J.P., Schnell M.J., Dietzschold B. Reinvestigation of the role of the ra- bies virus glycoprotein in viral pathogenesis using a reverse genetics approach. J. Neurovirol. 2000; 6(5):373–81. DOI: 10.3109/13550280009018301.

11. Li C., Zhang H., Ji L., Wang X., Wen Y., Li G., Fu Zh.F., Yang Y. Deficient incorporation of rabies virus glycoprotein into viri- ons enhances virus-induced immune evasion and viral pathogenicity. Viruses. 2019; 11(3):218. DOI: 10.3390/v11030218.

12. Schnee M., Vogel A.B., Voss D., Petsch B., Baumhof P., Kramps T., Stitz L. An mRNA vaccine encoding rabies virus glyco- protein induces protection against lethal infection in mice and corre- lates of protection in adult and newborn pigs. PLoS Negl. Trop. Dis. 2016; 10(6):e0004746. DOI: 10.1371/journal.pntd.0004746.

13. Ramya R., Mohana Subramanian B., Sivakumar V., Senthilkumar R.L., Sambasiva Rao K.R.S., Srinivasan V.A. Expression and solubilization of insect cell-based rabies virus gly- coprotein and assessment of its immunogenicity and protective ef- ficacy in mice. Clin. Vaccine Immunol. 2011; 18(10):1673–9. DOI: 10.1128/CVI.05258-11.

14. Osakada F., Callaway E.M. Design and generation of re- combinant rabies virus vectors. Nat. Protoc. 2013; 8(8):1583–601. DOI: 10.1038/nprot.2013.094.

15. Sokol F., Stancek D., Koprowski H. Structural proteins of rabies virus. J. Virol. 1971; 7(2):241–9. DOI: 10.1128/JVI.7.2.241-249.1971.

16. Koser M.L., McGettigan J.P., Tan G.S., Smith M.E., Koprowski H., Dietzschold B., Schnell M.J. Rabies virus nucleo- protein as a carrier for foreign antigens. Proc. Natl Acad. Sci. USA. 2004; 101(25):9405–10. DOI: 10.1073/pnas.0403060101.

17. Masatani T., Ito N., Ito Yu., Nakagawa K., Abe M., Yamaoka S., Okadera K., Sugiyama M. Importance of rabies virus nucleopro- tein in viral evasion of interferon response in the brain. Microbiol Immunol. 2013; 57(7):511–7. DOI: 10.1111/1348-0421.12058.

18. Faber M., Pulmanausahakul R., Hodawadekar S.S., Spitsin S., McGettigan J.P., Schnell M.J., Dietzschold B. Overexpression of the Rabies virus glycoprotein results in enhancement of apoptosis and antiviral immune response. J. Virol. 2002; 76(7):3374–81. DOI: 10.1128/jvi.76.7.3374-3381.2002.

19. Gupta P.K., Sharma S., Walunj S.S., Chaturvedi V.K., Raut A.A., Patial S., Rai A., Pandey K D., Saini M. Immunogenic and antigenic properties of recombinant soluble glycoprotein of rabies virus. Vet. Microbiol. 2005; 1:108(3-4):207–14. DOI: 10.1016/j.vetmic.2005.04.007.

20. Cox J.H., Dietzschold B., Schneider L.G. Rabies virus glycoprotein. II. Biological and serological characterization. Infect. Immun. 1977; 16(3):754–9. DOI: 10.1128/IAI.16.3.754-759.1977.

21. Dastkhosh M., Rahimi P., Haghighat S., Biglari P., Howaizi N., Saghiri R., Roohandeh A. Cell culture extraction and purifica- tion of rabies virus nucleoprotein. Jundishapur J. Microbiol. 2014; 7(9):е11734. DOI: 10.5812/jjm.11734.

22. Smith G., Liu Y. Rabies glycoprotein virus-like particles (VLPs). 2012; WO/2012/061815.

23. Trabelsi K., Ben Zakour M., Kallel H. Purification of rabies virus produced in Vero cells grown in serum free medium. Vaccine. 2019; 37(47):7052–60. DOI: 10.1016/j.vaccine.2019.06.072.

24. Targovnik A.M., Ferrari A., Mc Callum G.J., Arregui M.B., Smith I., Bracco L.F., Alfonso V., Lopez M.G., Martinez-Solis M., Herrero S., Miranda M.V. Highly efficient production of rabies vi- rus glycoprotein G ectodomain in Sf9 insect cells. 3 Biotech. 2019; 9(11):385. DOI: 10.1007/s13205-019-1920-4.

25. Sokol F., Kuwert E., Wiktor T.J., Hummeler K., Koprowski H. Purification of rabies virus grown in tissue culture. J. Virol. 1968; 2(8):836–49. DOI: 10.1128/JVI.2.8.836-849.1968.

26. Laemmli U.K. Cleavage of structural proteins dur- ing the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 1970; 227(5259):680–5. DOI: 10.1038/227680a0.

27. Ахмадеев Р.М., Ефимова М.А., Чернов А.Н., Мухамеджанова А.Г., Арсланова А.Ф., Шуралев Э.А., Хаертынов К.С., Никитин А.И., Макаев Х.Н. Способ получения антигена вируса бешенства для серологической диагностики. Патент РФ № 2694836. 14.12.2018, опубл. 17.07.2019. Бюл. № 20.

28. Asenjo J.A., Andrews B.A. Aqueous two-phase sys- tems for protein separation: phase separation and applica- tions. J. Chromatogr. A. 2012; 18;1238:1–10. DOI: 10.1016/j.chroma.2012.03.049.

29. Gaudin Y., Ruigrok R.W., Knossow M., Flamand A. Low‑pH conformational changes of rabies virus glycoprotein and their role in membrane fusion. J. Virol. 1993; 67(3):1365–72. DOI: 10.1128/JVI.67.3.1365-1372.1993.

30. Nadyrova A.I., Efimova M.A., Mukhamedzhanova A.G., Chernov A.N., Makaev H.N. Obtaining rabies virus purified an- tigen. As. J. Pharm. 2018; 12(4):1299–303. DOI: 10.22377/ajp.v12i04.2926.