Экспериментальный пероксидазный конъюгат для выявления специфических антител к возбудителю сибирской язвы в иммуноферментном анализе

Сибирская язва представляет собой актуальную проблему для ветеринарии и здравоохранения многих стран, включая Российскую Федерацию, что обусловливает необходимость совершенствования и разработки новых, чувствительных и специфичных диагностических средств.

Цель работы – создание экспериментального пероксидазного конъюгата для выявления специфических антител к возбудителю сибирской язвы и оптимизация условий проведения иммуноферментного анализа (ИФА).

Материалы и методы. Для конструирования пероксидазного конъюгата использовали пероксидазу хрена и белок А Staphylococcus aureus (Sigma-Aldrich, США). В качестве сенсибилизирующих агентов применяли бактериальные антигены, выделенные из штаммов Bacillus anthracis 55ΔТПА -1Spo, B. anthracis Sterne 34 F2. Разработанные экспериментальные серии конъюгата исследовали в ИФА на способность связывать антитела сывороток крови больных сибирской язвой и вакцинированных лиц. Чувствительность, специфичность и точность метода рассчитывали с помощью встроенных функций пакета ROCR.

Результаты и обсуждение. Разработан пероксидазный конъюгат для выявления специфических антител к возбудителю сибирской язвы при исследовании клинического материала, оптимизированы условия постановки ИФА. Для интерпретации результатов исследования использовали пороговое значение коэффициента позитивности, меньше которого результат считали отрицательным, а при равном или большем значении – положительным. В ходе испытания получены достоверные отличия в показателе «коэффициент позитивности» для групп «Здоровые»/«Больные» и «Здоровые»/«Вакцинированные», тогда как отличия между группами «Больные»/«Вакцинированные» были статистически незначимы. Максимальная точность метода наблюдалась при разведении сывороток крови 1:250 и 1:500. Установлена 100 % внутрипостановочная, межпостановочная и межсерийная воспроизводимость для всех положительных образцов. Чувствительность и специфичность экспериментальных пероксидазных конъюгатов составила соответственно 100 и 95,8 %, а точность – 97,6 %.

1. Pilo P., Frey J. Pathogenicity, population genetics and dissemination of Bacillus anthracis. Infect. Genet. Evol. 2018; 64:115– 25. DOI: 10.1016/j.meegid.2018.06.024.

2. Koehler T.M. Bacillus anthracis physiology and genetics. Mol. Aspects Med. 2009; 30(6):386–96. DOI: 10.1016/j.mam.2009.07.004.

3. Chateau A., Van der Verren S.E., Remaut H., Fioravanti A. The Bacillus anthracis cell envelope: composition, physiological role, and clinical relevance. Microorganisms. 2020; 8(12):1864. DOI: 10.3390/microorganisms8121864.

4. Pilo P., Frey J. Bacillus anthracis: molecular taxonomy, population genetics, phylogeny and patho-evolution. Infect. Genet. Evol. 2011; 11(6):1218–24. DOI: 10.1016/j.meegid.2011.05.013.

5. Doganay M., Demiraslan H. Human anthrax as a re-emerging disease. Recent Pat. Anti-Infect. Drug Discov. 2015; 10(1):10–29. DOI: 10.2174/1574891x10666150408162354.

6. Попова А.Ю., Куличенко А.Н., редакторы. Опыт ликвидации вспышки сибирской язвы на Ямале в 2016 году. Ижевск: Принт-2; 2017. 313 с.

7. Аксенова Л.Ю., Рязанова А.Г., Жданова Е.В., Цыганкова О.И., Буравцева Н.П., Еременко Е.И., Тюменцева И.С., Коготкова О.И., Зуенко А.А., Куличенко А.Н. Разработка и апробация тест-системы для обнаружения антител к возбудителю сибирской язвы непрямым методом флуоресцирующих антител. Проблемы особо опасных инфекций. 2013; 4:76–8. DOI: 10.21055/0370-1069-2013-4-76-78.

8. Grundmann O. The current state of bioterrorist attack surveillance and preparedness in the US. Risk Manag. Healthc. Policy. 2014; 7:177–87. DOI: 10.2147/RMHP.S56047.

9. Сысуев Е.Б., Поздняков А.М., Стрыгин А.В., Ираклионова Н .С. Основные принципы диагностики бактериальных поражений. Сибирская язва. Международный журнал прикладных и фундаментальных исследований. 2013; 7:95–6.

10. Marcus H., Danieli R., Epstein E., Velan B., Shafferman A., Reuveny S. Contribution of immunological memory to protective immunity conferred by a Bacillus anthracis protective antigenbased vaccine. Infect. Immun. 2004; 72(6):3471–7. DOI: 10.1128/IAI.72.6.3471-3477.2004.

11. Reuveny S., White M.D., Adar Y.Y., Kafri Y., Altboum Z., Gozes Y., Kobiler D., Shafferman A., Velan B. Search for correlates of protective immunity conferred by anthrax vaccine. Infect. Immun. 2001; 69(5):2888–93. DOI: 10.1128/IAI.69.5.2888-2893.2001.

12. Quinn C.P., Semenova V.A., Elie C.M., Romero-Steiner S., Greene C., Li H., Stamey K., Steward-Clark E., Schmidt D.S., Mothershed E., Pruckler J., Schwartz S., Benson R.F., Helsel L.O., Holder P.F., Johnson S.E., Kellum M., Messmer T., Thacker W.L., Besser L., Plikaytis B.D., Taylor T.H. Jr, Freeman A.E., Wallace K.J., Dull P., Sejvar J., Bruce E., Moreno R., Schuchat A., Lingappa J.R., Martin S.K., Walls J., Bronsdon M., Carlone G.M., Bajani-Ari M., Ashford D.A., Stephens D.S., Perkins B.A. Specific, sensitive, and quantitative enzyme-linked immunosorbent assay for human immunoglobulin G antibodies to anthrax toxin protective antigen. Emerg. Infect. Dis. 2002; 8(10):1103–10. DOI: 10.3201/eid0810.020380.

13. Kingston J.J., Majumder S., Uppalapati S.R., Makam S.S., Urs R.M., Murali H.S., Batra H.V. Anthrax outbreak among cattle and its detection by extractable antigen 1 (EA1) based sandwich ELISA and immuno PCR. Indian J. Microbiol. 2015; 55:29–34. DOI: 10.1007/s12088-014-0494-4.

14. Hassan J., Rahman M.B., Chowdhury S.M.Z.H., Rabidas S.K., Parvej M.S., Nazir K.N.H.N.H. ELISA based anthrax antibody titer in cattle induced by locally prepared anthrax vaccine originated from Sterne F-24 strain in Bangladesh. Microbes Health. 2015; 4(1):36–8. DOI: 10.3329/mh.v4i1.23104.

15. Ghosh N., Goel A.K. Anti-protective antigen IgG enzymelinked immunosorbent assay for diagnosis of cutaneous anthrax in India. Clin. Vaccine Immunol. 2012; 19(8):1238–42. DOI: 10.1128/CVI.00154-12.

16. Wilson M.B., Nakane P.K. Recent developments in the periodate method of conjugating horseradish peroxidase (HRPO) to antibodies. In: Knapp W., Holubar K., Wick G., editors. Immunofluorescence and Related Staining Techniques. Amsterdam: Elsevier/North-Holland Biomedical Press; 1978. P. 215–24.

17. Микшис Н.И., Попова П.Ю., Семакова А.П., Кудрявцева О.М., Бугоркова С.А., Кравцов А.Л. Изучение влияния антигенов, полученных из рекомбинантного штамма Bacillus anthracis 55ΔTПА-1Spo-, на органы и ткани иммунизированных животных. Биотехнология. 2017; 33(5):45–60. DOI: 10.21519/0234-2758-2017-33-5-45-60.

18. Горобец Е.А., Афанасьев Е.Н., Тюменцева И.С., Василенко Н.Ф. Совершенствование способа получения иммунных кроличьих сибиреязвенных капсульно-соматических сывороток. Медицинский вестник Северного Кавказа. 2008; 1:42–4.

19. R Core Team (2020). R: A language and environment for statistical computing. R Foundation for Statistical Computing, Vienna, Austria. [Электронный ресурс]. URL: https://www.R-project.org.

20. Wickham H., Averick M., Bryan J., Chang W., D’Agostino McGowan L., Francois R., Grolemund G., Hayes A., Henry L., Hester J., Kuhn M., Pedersen T.L., Miller E., Bache S.M., Muller K., Ooms J., Robinson D., Seidel D.P., Spinu V., Takahashi K., Vaughan D., Wilke C., Woo K., Yutani H. Welcome to the tidyverse. J. Open Source Softw. 2019; 4(43):1686. DOI: 10.21105/joss.01686.

21. Sing T., Sander O., Beerenwinkel N., Lengauer T. ROCR: visualizing classifier performance in R. Bioinformatics. 2005; 21(20):3940–1. DOI: 10.1093/bioinformatics/bti623.

22. Alboukadel Kassambara (2020). ggpubr: ‘ggplot2’ Based Publication Ready Plots. [R package version 0.4.0]. [Электронный ресурс]. URL: https://CRAN.R-project.org/package=ggpubr.

23. Пономаренко Д.Г., Ракитина Е.Л., Костюченко М.В., Логвиненко О.В., Рязанова А.Г., Аксенова Л.Ю., Буравцева Н.П., Тюменцева И.С., Курчева С.А., Куличенко А.Н. Применение CAST-теста для оценки у людей специфической реактивности к возбудителю сибирской язвы. Медицинская иммунология. 2020; 22(5):1017–24. DOI: 10.15789/1563-0625-UCT-2058.