Сравнительный анализ экспрессии основных генов вирулентности у различных штаммов Vibrio сholerae О1

Цель – сравнительное изучение экспрессии основных генов вирулентности у штаммов Vibrio cholerae классического биовара, типичных и генетически измененных штаммов V. cholerae биовара Эль Тор.

Материалы и методы. В качестве модельных использовали природные токсигенные штаммы V. cholerae О1 классического биовара (J89, Пакистан, 1969 г.), типичного (М-887, Астрахань, 1970 г.) и генетически измененного (301, Таганрог, 2011 г.) штаммов биовара Эль Тор. Штаммы выращивали в оптимальных для продукции холерного токсина и токсинкорегулируемых пилей условиях. Исследование роста штаммов проводили на бульоне LB при комнатной температуре с определением количества клеток на спектрофотометре Biowave DNA (Biochrome Ltd., Великобритания). Определение экспрессии генов осуществляли с помощью ПЦР в реальном времени с обратной транскрипцией.

Результаты и обсуждение. Изучена экспрессия структурных (ctxA, tcpA) и регуляторных (toxR, toxT, tcpP, tcpH) генов вирулентности у штаммов холерного вибриона классического биовара, типичного и генетически измененного штаммов биовара Эль Тор. Выявлены значительные различия по времени и уровню максимальной экспрессии указанных генов у штаммов классического и Эль Тор биоваров. Установлено, что экспрессия генов ctxA и toxR у штамма геноварианта достигала своего максимума на 1–3 ч раньше других штаммов. При этом уровень экспрессии гена ctxA соответствовал уровню классического штамма. Максимальная экспрессия гена toxR у штамма геноварианта была выше, чем у типичного Эль Тор и классического штаммов, а также имела четкую обратную корреляцию с экспрессией гена ctxA. Экспрессия генов tcpA, toxT и tcpH у штамма классического биовара достигала максимума на 1–2 ч раньше, чем у штаммов биовара Эль Тор. Указанные различия следует учитывать при проведении научно-исследовательских работ, связанных с изучением экспрессии основных генов вирулентности.

1. Karaolis D.K., Somara S., Maneval D.R. Jr., Johnson J.A., Kaper J.B. A bacteriophage encoding a pathogenicity island, a type-IV pilus and a phage receptor in cholera bacteria. Nature. 1999; 399(6734):375–9. DOI: 10.1038/20715.

2. Смирнова Н.И., Заднова С.П., Агафонов Д.А., Шашкова А.В., Челдышова Н.Б., Черкасов А.В. Сравнительный молекулярно-генетический анализ мобильных элементов природных штаммов возбудителей холеры. Генетика. 2013; 49(9):1036–47. DOI: 10.7868/S0016675813090087.

3. Matson J.S., Withey J.H., DiRita V.J. Regulatory networks controlling Vibrio cholerae virulence gene expression. Infect. Immun. 2007; 75(12):5542–9. DOI: 10.1128/IAI.01094-07.

4. Смирнова Н.И., Агафонов Д.А., Кульшань Т.А., Щелканова Е.Ю., Краснов Я.М., Лозовский Ю.В., Кутырев В.В. Влияние делеции профага СТХφ возбудителя холеры на экспрессию регуляторных генов, контролирующих вирулентность и образование биопленки. Генетика. 2017; 53(3):284–97. DOI: 10.7868/S0016675817020114.

5. DiRita V.J., Parsot C., Jander G., Mekalanos J.J. Regulatory cascade controls virulence in Vibrio cholerae. Proc. Natl Acad. Sci. USA. 1991; 88(12):5403–7. DOI: 10.1073/pnas.88.12.5403.

6. Hase C.C., Mekalanos J.J. TcpP protein is a positive regulator of virulence gene expression in Vibrio cholerae. Proc. Natl Acad. Sci. USA. 1998; 95(2):730–4. DOI: 10.1073/pnas.95.2.730.

7. Krukonis E.S., Yu R.R., Dirita V.J. The Vibrio cholerae ToxR/ TcpP/ToxT virulence cascade: distinct roles for two membrane-localized transcriptional activators on a single promoter. Mol. Microbiol. 2000; 38(1):67–84. DOI: 10.1046/j.1365-2958.2000.02111.x.

8. Li N., Zheng Y., Shi M., Xue Y., Zhang T., Ji S., Yang M. TcpP L152A constitutively activating virulence gene expression in Vibrio cholerae. Curr. Microbiol. 2019; 76(5):583–9. DOI: 10.1007/s00284-019-01659-y.

9. Hung D.T., Mekalanos J.J. Bile acids induce cholera toxin expression in Vibrio cholerae in a ToxT-independent manner. Proc. Natl Acad. Sci. USA. 2005; 102(8):3028–33. DOI: 10.1073/pnas.0409559102.

10. Kovacikova G., Skorupski K. Differential activation of the tcpPH promoter by AphB determines biotype specificity of virulence gene expression in Vibrio cholerae. J. Bacteriol. 2000; 182(11):3228– 38. DOI: 10.1128/JB.182.11.3228-3238.2000.

11. Safa A., Nair G.B., Kong R.Y.С. Evolution of new variants of Vibrio cholerae O1. Trends Microbiol. 2010; 18(1):46–54. DOI: 10.1016/j.tim.2009.10.003.

12. Nair G.B., Faruque S.M., Bhuiyan N.A., Kamruzzaman M., Siddique A.K., Sack D.A. New variants of Vibrio cholerae O1 biotype El Tor with attributes of the classical biotype from hospitalized patients with acute diarrhea in Bangladesh. J. Clin. Microbiol. 2002; 40(9):3296–9. DOI: 10.1128/JCM.40.9.3296-3299.2002.

13. Safa A., Sultana J., Dac Cam P., Mwansa J.C., Kong R.Y. Vibrio cholerae O1 hybrid El Tor strains, Asia and Africa. Emerg. Infect. Dis. 2008; 14(6):987–8. DOI: 10.3201/eid1406.080129.

14. Носков А.К., Кругликов В.Д., Москвитина Э.А., Монахова Е.В., Левченко Д.А., Янович Е.Г., Водопьянов А.С., Писанов Р.В., Непомнящая Н.Б., Ежова М.И., Подойницына О.А. Характеристика эпидемиологической ситуации по холере в мире и в Российской Федерации в 2020 г. и прогноз на 2021 г. Проблемы особо опасных инфекций. 2021; 1:43–51. DOI: 10.21055/0370-1069-2021-1-43-51.

15. Ghosh-Banerjee J., Senoh M., Takahashi T., Hamabata T., Barman S., Koley H., Mukhopadhyay A.K., Ramamurthy T., Chatterjee S., Asakura M., Yamasaki S., Nair G.B., Takeda Y. Cholera toxin production by the El Tor variant of Vibrio cholerae O1 compared to prototype El Tor and classical biotypes. J. Clin. Microbiol. 2010; 48(11):4283–6. DOI: 10.1128/JCM.00799-10.

16. Grim C.J., Choi J., Chun J., Jeon Y.-S., Taviani E., Hasan N.A., Haley B., Huq A., Colwell R.R. Occurrence of the Vibrio cholerae seventh pandemic VSP-I island and a new variant. OMICS. 2010; 14(1):1–7. DOI: 10.1089/omi.2009.0087.

17. Nair G.B., Qadri F., Holmgren J., Svennerholm A.-M., Safa A., Bhuiyan N.A., Ahmad Q.S., Faruque S.M., Faruque A.S.G., Takeda Y., Sack D.A. Cholera due to altered El Tor strains of Vibrio cholerae O1 in Bangladesh. J. Clin. Microbiol. 2006; 44(11):4211–3. DOI: 10.1128/JCM.01304-06.

18. Beyhan S., Tischler A.D., Camilli A., Yildiz F.H. Differences in gene expression between the classical and El Tor biotypes of Vibrio cholerae O1. Infect. Immun. 2006; 74(6):3633–42. DOI: 10.1128/IAI.01750-05.

19. DiRita V.J., Neely M., Taylor R.K., Bruss P.M. Differential expression of the ToxR regulon in classical and El Tor biotypes of Vibrio cholerae is due to biotype – specific over tox T expression. Proc. Natl Acad. Sci. USA. 1996; 93(15):7991–5. DOI: 10.1128/IAI.01750-05.

20. Lee S.H., Hava D.L., Waldor M.K., Camilli A. Regulation and temporal expression patterns of Vibrio cholerae virulence genes during infection. Cell. 1999; 99(6):625–34. DOI: 10.1016/s0092-8674(00)81551-2.

21. Murley Y.M., Behari J., Griffin R., Calderwood S.B. Classical and El Tor biotypes of Vibrio cholerae differ in timing of transcription of tcpPH during growth in inducing conditions. Infect. Immun. 2000; 68(5):3010–4. DOI: 10.1128/IAI.68.5.30103014.2000.

22. Крицкий А.А., Челдышова Н.Б., Тучков И.В., Смирнова Н.И. Разработка алгоритма определения уровня экспрессии генов ctxА и toxR Vibrio cholerae методом ОТ-ПЦР с гибридизационнофлуоресцентным учетом результатов в режиме реального времени. Проблемы особо опасных инфекций. 2017; 3:53–7. DOI: 10.21055/0370-1069-2017-3-53-57.

23. Fykse E.M., Skogan G., Davies W., Olsen J.S., Blatny J.M. Detection of Vibrio cholerae by real-time nucleic acid sequencebased amplification. Appl. Environ. Microbiol. 2007; 73(5):1457–66. DOI: 10.1128/AEM.01635-06.

24. Livak K.J., Schmittgen T.D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2–ΔΔCt method. Methods. 2001; 25(4):402–8. DOI: 10.1006/meth.2001.1262.

25. Адамов А.К., Наумшина М.С. Холерные вибрионы. Саратов: Изд-во Саратовского университета; 1984. 328 с.