Прямое количественное определение белковых антигенов в препаратах субъединичных чумных и риккетсиозных вакцин

Цель работы – предложить методические приемы прямого количественного определения специфических белковых антигенов Yersinia pestis и Rickettsia raoultii в препаратах и различных прототипах субъединичных вакцин. Материалы и методы. В качестве модельных использовали антигены Y. pestis LcrV и Caf1, заключенные в субстанцию вакцины чумной молекулярной микроинкапсулированной (ВЧММ ) и раздельно, в микрокристаллы аминокислот, соосажденных с белками чумного микроба. Антигены R. raoultii Adr2, OmpB24, YbgF адсорбировали прототипом субстанции риккетсиозной вакцины. Освобождение чумных антигенов из микрокапсул ВЧММ проводили последовательной обработкой последних органическими растворителями метиленхлоридом и метанолом соответственно, микрокристаллы-носители растворяли 0,1 М натрий-цитратным буфером, рН 6,0. Антигены в прототипе субстанции риккетсиозной вакцины определяли измерением количества белков, не связывающихся с алюмогелем. Количественные параметры, характеризующие содержание антигенов в субстанциях и прототипах вакцинных препаратов, вычисляли в результате обработки цифровых изображений полиакриламидных гелей, полученных электрофорезом фракций белковых антигенов, экстрагированных из носителей. Результаты и обсуждение. Изучены не вызывающие деградацию белка способы прямой экстракции и последующего количественного анализа антигенов Y. pestis LcrV и Caf1 из препаратов субъединичных вакцин на основе микрокристаллов аминокислот и полилактидных микрокапсул. Установлен различный характер связывания LcrV и Caf1 в субстанциях микрокристаллов, при этом количественно определена доля антигенов, освобождающихся из микрокристаллов только в результате их полного растворения. Выявлено, что при низких концентрациях белков LcrV и Caf1, экстрагированных из микрокристаллов, для их уверенной визуализации необходимо концентрирование экстрактов с последующим удалением солей. Подтверждено, что 10 мкг чумных антигенов и белков R. raoultii в объеме дозы введения 200 мкл суспензии достаточно для количественного анализа электрофоретическим методом. Обсуждаются перспективы альтернативных прямой экстракции антигенов иных физико-химических методов оценки состава и качества вакцинных препаратов.

1. Benne N., van Duijn J., Kuiper J., Jiskoot W., Slütter B. Orchestrating immune responses: How size, shape and rigidity affect the immunogenicity of particulate vaccines. J. Control Release. 2016; 234:124–34. DOI: 10.1016/j.jconrel.2016.05.033.

2. Baranov M.V., Kumar M., Sacanna S., Thutupalli S., van den Bogaart G. Modulation of immune responses by particle size and shape. Front. Immunol. 2021; 11:607945. DOI: 10.3389/fimmu.2020.607945.

3. Государственная фармакопея Российской Федерации. XIV изд. Т. 4. М.; 2018. С. 5326–36.

4. Воробьева С.А., Дуракова О.С., Громова О.В., Волох О.А., Клокова О.Д., Никифоров А.К. Антигенные компоненты холерной бивалентной химической вакцины, методы их выделения и контроля. Проблемы особо опасных инфекций. 2022; 2:12–9. DOI: 10.21055/0370-1069-2022-2-12-19.

5. Копылов П.Х., Светоч Т.Э., Иванов С.А., Комбарова Т.И., Перовская О.Н., Титарева Г.М., Анисимов А.П. Особенности хроматографической очистки и протективности изоформ LcrV Yersinia pestis. Прикладная биохимия и микробиология. 2019; 55(5):471–80. DOI: 10.1134/s0555109919040081.

6. Дятлов И.А., Сомов А.Н., Дунайцев И.А., Копылов П.Х., Иванов С.А., Борзилов А.И., Анисимов А.П., Храмов М .В. Рекомбинантный вакцинный препарат пролонгированного действия для профилактики чумы у млекопитающих и человека и способ его получения. Патент РФ № 2671525 C2, опубл. 01.11.2018. Бюл. № 31.

7. Jones S., Asokanathan C., Kmiec D., Irvine J., Fleck R., Xing D., Moore B., Parton R., Coote J. Protein coated microcrystals formulated with model antigens and modified with calcium phosphate exhibit enhanced phagocytosis and immunogenicity. Vaccine. 2014; 32(33):4234–42. DOI: 10.1016/j.vaccine.2013.09.061.

8. Laemmli U.K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 1970; 227(5259):680–5. DOI: 10.1038/227680a0.

9. Sheridan С. The business of making vaccines. Nat. Biotechnol. 2005; 23(11):1359–66. DOI: 10.1038/nbt1105-1359.

10. ICH – International Conference on Harmonisation Regulations. Q7 – GMP Guide for Active Pharmaceutical Ingredients; Q8(R2) – Pharmaceutical Development; Q9 – Quality Risk Management; Q10 – Pharmaceutical Quality System; Q11 – Development and Manufacture of Drug Substances (Chemical Entities and Biotechnological/Biological Entities). [Электронный ресурс]. URL: https://www.gmppublications.com/product185.html (дата обращения 14.12.2022).

11. Сомов А.Н., Дубровский А.В., Дунайцев И.А., Иванов С.А., Комбарова Т.И., Кочеткова О.Ю., Кравченко Т.Б., Титарева Г.М., Тихоненко С.А., Пинчук А.С., Фирстова В.В., Дентовская С.В. Иммуногенные свойства полиэлектролитных микрокапсул, нагруженных антигенами Francisella tularensis или Yersinia pestis. Иммунология. 2019; 40(5):52–61. DOI: 10.24411/0206-4952-2019-15006.

12. Кочеткова О.Ю., Казакова Л.И., Мошков Д.А., Винокуров М.Г., Шабарчина Л.И. Включение белков в полиэлектролитные микрокапсулы методами копреципитации и адсорбции. Биоорганическая химия. 2013; 39(5):565–71. DOI: 10.7868/S0132342313050084.

13. Herrington W.F. Jr., Singh G.P., Wu D., Barone P.W., Hancock W., Ram R.J. Optical detection of degraded therapeutic proteins. Sci. Rep. 2018; 8(1):5089. DOI: 10.1038/s41598-018-23409-z.

14. Yang Y., Su Z., Ma G., Zhang S. Characterization and stabilization in process development and product formulation for super large proteinaceous particles. Eng. Life Sci. 2020; 20(11):451–65. DOI: 10.1002/elsc.202000033.

15. Буданова А.А., Щуковская Т.Н. Исследования in silico на этапах конструирования современных средств иммунопрофилактики чумы (на примере субъединичных вакцин). Проблемы особо опасных инфекций. 2022; 3:6–13. DOI: 10.21055/0370-1069-2022-3-6-13.