Применение HRM-анализа кривых плавления, полученных после амплификации VNTR-локусов, для идентификации и дифференциации штаммов бруцелл

Цель исследования – оценка эффективности анализа кривых плавления высокого разрешения, полученных после амплификации VNTR-локусов, для идентификации и дифференциации штаммов бруцелл.

Материалы и методы. В качестве объектов исследования использовали 16 штаммов бруцелл видов Brucella canis (n=1), B. abortus (n=9), B. melitensis (n=2) и B. suis (n=4) различного географического происхождения. MLVA-типирование проводили методом классической ПЦР с последующим разделением ампликонов в агарозном геле и методом ПЦР-РВ с пост-амплификационным анализом кривых плавления VNTR-локусов в присутствии интеркалирующего красителя SybrGreen. Биоинформационный анализ выполняли с помощью программ Vector NTI 9.1 и Mega 11 (алгоритм MUSCLE). Филогенетический анализ проводили методом UPGMA с помощью программы Mega 11.

Результаты и обсуждение. С помощью MLVA-подхода, основанного на анализе кривых плавления ПЦР-продуктов, полученных после амплификации VNTR-локусов, показано, что каждый из 16 штаммов бруцелл характеризуется уникальным профилем температур плавления. Методом ПЦР с последующим электрофорезом установлено, что, несмотря на высокую вариабельность использованных VNTR-последовательностей (h=0,48…0,74), только пост-амплификационные кривые плавления локусов Bru7, Bru9, Bru18, Bru21 обладали достаточной информативностью для определения генетического полиморфизма исследованных штаммов бруцелл. На основании филогенетического анализа последовательностей Bru7, Bru9, Bru18, Bru21 показано, что большинство исследуемых штаммов бруцелл распределялись на дендрограмме в соответствии с их таксономическим и географическим положением. Таким образом, HRM-анализ кривых плавления, полученных после амплификации локусов Bru7, Bru9, Bru18, Bru21, имеет потенциал использования для дифференциации штаммов бруцелл.

1. El-Sayed A., Awad W. Brucellosis: Evolution and expected comeback. Int. J. Vet. Sci. Med. 2018; 6(Suppl.):S31–S35. DOI: 10.1016/j.ijvsm.2018.01.008.

2. Пономаренко Д.Г., Скударева О.Н., Хачатурова А.А., Лукашевич Д.Е., Жаринова И.В., Даурова А.В., Германова А.Н., Логвиненко О.В., Ракитина Е.Л., Костюченко М.В., Манин Е.А., Малецкая О.В., Куличенко А.Н. Бруцеллез: тенденции развития ситуации в мире и прогноз на 2022 г. в Российской Федерации. Проблемы особо опасных инфекций. 2022; 2:36–45. DOI: 10.21055/0370-1069-2022-2-36-45.

3. Suárez-Esquivel M., Chaves-Olarte E., Moreno E., Guzmán-Verri C. Brucella genomics: Macro and micro evolution. Int. J. Mol. Sci. 2020; 21(20):7749. DOI: 10.3390/ijms21207749.

4. Писаренко С.В., Ковалев Д.А., Хачатурова А.А., Волынкина А.С., Русанова Д.В., Куличенко А.Н. Филогеография штаммов Brucella melitensis на основе анализа SNP полных геномов. Бактериология. 2016; 1(1):73–9. DOI: 10.20953/2500-1027-2016-1-73-79.

5. Насибуллин Р.Ю., Тухватуллина Л.А., Богова Я.А., Сафина Г.М., Косарев М.А. Бруцеллез: его распространение и профилактика. Ветеринарный врач. 2021; 1:38–43. DOI: 10.33632/1998-698x.2021-1-38-44.

6. Liu Z.-G., Di D.-D., Wang M., Liu R.-H., Zhao H.-Y., Piao D.-R., Tian G.-Z., Fan W.-X., Jiang H., Cui B.-Y., Xia X.-Z. MLVA genotyping characteristics of human Brucella melitensis isolated from Ulanqab of Inner Mongolia, China. Front. Microbiol. 2017; 8:6. DOI: 10.3389/fmicb.2017.00006.

7. Шакирова Л.И., Ляпустина Л.В., Головнева С.И., Швецова Н.М. Применение молекулярно-генетических методов для характеристики клинических изолятов бруцеллезного микроба. Эпидемиология и вакцинопрофилактика. 2014; 2:54–9.

8. Кузнецова И.В., Ковалев Д.А., Евченко Ю.М., Шакирова Л.И., Швецова Н.М., Пономаренко Д.Г., Писаренко С.В., Жиров А.М., Лукина А.А., Куличенко А.Н. Изучение генетического разнообразия штаммов бруцелл, выделенных в Северо-Кавказском федеральном округе. Проблемы особо опасных инфекций. 2017; 3:58–62. DOI: 10.21055/0370-1069-2017-3-58-62.

9. Хачатурова А.А., Пономаренко Д.Г., Ковалев Д.А., Германова А.Н., Лукашевич Д.Е., Русанова Д.В., Сердюк Н.С., Семенко О.В., Жиров А.М., Катунина Л.С., Куличенко А.Н. Анализ заболеваемости людей бруцеллёзом и молекулярно-биологическая характеристика изолятов Brucella melitensis на длительно неблагополучных по бруцеллёзу территориях юга европейской части России. Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. 2022; 99(1):63–74. DOI: 10.36233/0372-9311-185.

10. Анисимова Е.А., Фахрутдинов Н.А., Миргазов Д.А., Додонова Е.А., Елизарова И.А., Горбунова М.Е., Хаммадов Н.И., Зайнуллин Л.И., Осянин К.А. Дифференциация штаммов Bacillus anthracis на основе SNP- и VNTR-полиморфизма геномов. Вавиловский журнал генетики и селекции. 2022; 26(6):560–7. DOI: 10.18699/VJGB-22-68.

11. Фахрутдинов Н.А., Анисимова Е.А., Миргазов Д.А., Мустафина Э.Н., Осянин К.А. Дифференциация штаммов Bacillus anthracis методом анализа температур плавления продуктов ПЦР, полученных после амплификации VNTR локусов. Ветеринарный врач. 2023; 2:41–6. DOI: 10.33632/1998-698X_2023_2_41.

12. Хаммадов Н.И., Осянин К.А., Усольцев К.В., Фаизов Т.Х., Хаммадова А.В., Шуралев Э.А. Маркерные локусы генома бруцелл для дифференциальной ПЦР индикации патогенных штаммов. Проблемы особо опасных инфекций. 2018; 3:88–93. DOI: 10.21055/0370-1069-2018-3-88-93.

13. Le Flèche P., Jacques I., Grayon M., Al Dahouk S., Bouchon P., Denoeud F., Nöckler K., Neubauer H., Guilloteau L.A., Vergnaud G. Evaluation and selection of tandem repeat loci for а Brucella МLVA typing assay. BMC Microbiol. 2006; 6:9. DOI: 10.1186/1471-2180-6-9.

14. Selander R.K., Caugant D.A., Ochman H., Musser J.M., Gilmour M.N., Whittam T.S. Methods of multilocus enzyme electrophoresis for bacterial population genetics and systematics. Appl. Environ. Microbiol. 1986; 51(5):873–84. DOI: 10.1128/aem.51.5.873-884.1986.

15. Ковалев Д.А., Кузнецова И.В., Жиров А.М., Сердюк Н.С., Жилченко Е.Б., Пономаренко Д.Г., Водопьянов А.С., Водопьянов С.О., Куличенко А.Н. Генетическое типирование штаммов Brucella melitensis на основе анализа вариабельности INDEL-локусов. Эпидемиология и инфекционные болезни. Актуальные вопросы. 2022; 12(1):81–6. DOI: 10.18565/epidem.2022.12.1.81-6.

16. Gopaul K.K., Sells J., Lee R., Beckstrom-Sternberg S.M., Foster J.T., Whatmore A.M. Development and assessment of multiplex high resolution melting assay as a tool for rapid single-tube identification of five Brucella species. BMC Res. Notes. 2014; 7:903. DOI: 10.1186/1756-0500-7-903.

17. Girault G., Perrot L., Mick V., Ponsart C. High-resolution melting PCR as rapid genotyping tool for Brucella species. Microorganisms. 2022; 10(2):336. DOI: 10.3390/microorganisms10020336.

18. Алимов А.М., Ахмадеев Р.М., Габидуллина Р.Г., Сазонова Т.Я. Штамм Brucella abortus УФ-1 для приготовления биологических препаратов для диагностики и специфической профилактики бруцеллеза сельскохозяйственных животных. Патент РФ № 2425148, опубл. 27.07.2011.

19. Кулаков Ю.К., Цирельсон Л.Е., Желудков М.М. Молекулярно-генетическая характеристика изолятов бруцелл, выделенных от собак и оленей в различных регионах России. Молекулярная генетика, микробиология и вирусология. 2012; 4:28–33. DOI: 10.3103/S0891416812040052.

20. Guzmán-Verri C., Suárez-Esquivel M., Ruíz-Villalobos N., Zygmunt M.S., Gonnet M., Campos E., Víquez-Ruiz E., Chacón-Díaz C., Aragón-Aranda B., Conde-Álvarez R., Moriyón I., Blasco J.M., Muñoz P.M., Baker K.S., Thomson N.R., Cloeckaert A., Moreno E. Genetic and phenotypic characterization of the etiological agent of canine orchiepididymitis smooth Brucella sp. BCCN84.3. Front. Vet. Sci. 2019; 6:175. DOI: 10.3389/fvets.2019.00175.