Полногеномное секвенирование и поиск детерминант формирования устойчивости к действию бензалкония хлорида у Burkholderia pseudomallei

Цель исследования – полногеномное секвенирование и сравнительный анализ исходного и резистентного к действию бензалкония хлорида штаммов Burkholderia pseudomallei.

Материалы и методы. В работе использованы штаммы: B. pseudomallei 134, B. pseudomallei 134К, устойчивый к бензалкония хлориду. Полногеномное секвенирование производили на платформе MiSeq Reagent Kit v3 (600-cycle). Сборку геномов обоих штаммов проводили с помощью ассемблера SPAdes v3.11.1. Для сравнения последовательностей геномов исследуемых штаммов использовали программу Snippy v4.6.0. Для построения выравниваний нуклеотидных и аминокислотных последовательностей применяли программный продукт MEGA X.

Результаты и обсуждение. Поиск и анализ детерминант, которые могут быть ответственны за появление устойчивости к биоцидам у B. pseudomallei 134K, выявили два гена: ген транскрипционного репрессора TetR и ген эффлюксной помпы AmrAB-OprA. В регуляторе TetR обнаружен однонуклеотидный полиморфизм, что обусловило замену серина на пролин в мутантном белке и, как следствие, изменение его вторичной структуры. Предполагается, что данная мутация ведет к потере функции белка-регулятора, в результате чего увеличивается экспрессия регулируемых им генов эффлюксной помпы (AcrB/AcrD/AcrF), в связи с чем происходит как снижение уровня чувствительности к бензалкония хлориду, так и появление резистентности к цефтазидиму. В гене эффлюксной помпы AmrAB-OprA выявлена инсерция 16 нуклеотидов в положении 544-го участка оперона amrA, что повлекло за собой увеличение длины цистрона, сдвиг рамки считывания, изменение аминокислотного состава вторичной структуры кодируемого протеина. Вероятнее всего, данная мутация приводит к потере функции оперона AmrAB-OprA и невозможности нормального оттока ксенобиотиков из цитоплазмы микроорганизма. Данное предположение подтверждается тем фактом, что мутантный штамм утратил устойчивость к гентамицину.

1. Cheng A.C., Currie B.J. Melioidosis: epidemiology, pathophysiology, and management. Clin. Microbiol. Rev. 2005; 18(2):383–416. DOI: 10.1128/CMR.18.2.383-416.2005.

2. Limmathurotsakul D., Golding N., Dance D.A., Messina J.P., Pigott D.M., Moyes C.L., Rolim D.B., Bertherat E., Day N.P., Peacock S.J., Hay S.I. Predicted global distribution of Burkholderia pseudomallei and burden of melioidosis. Nat. Microbiol. 2016; 1:15008. DOI: 10.1038/nmicrobiol.2015.8.

3. Wiersinga W.J., Virk H.S., Torres A.G., Currie B.J., Peacock S.J., Dance D.A.B., Limmathurotsakul D. Melioidosis. Nat. Rev. Dis. Primers. 2018; 4:17107. DOI: 10.1038/nrdp.2017.107.

4. Schweizer H.P. Mechanisms of antibiotic resistance in Burkholderia pseudomallei: implications for treatment of melioidosis. Future Microbiol. 2012; 7(12):1389–99. DOI: 10.2217/fmb.12.116.

5. Захарова И.Б., Топорков А.В., Викторов Д.В. Мелиоидоз в аспектах эпидемиологии, клиники и лабораторной диагностики. Инфекция и иммунитет. 2021; 11(3):409–22. DOI: 10.15789/2220-7619-MIA-1584.

6. Национальный справочно-аналитический портал о дезсредствах, зарегистрированных на территории РФ. [Электронный ресурс]. URL: http://dezreestr.ru/index.html (дата обращения 03.08.2023).

7. Реестр дезсредств. [Электронный ресурс]. URL: https://dezr.ru/ (дата обращения 05.08.2023).

8. de Vries L.E., Christensen H., Skov R.L, Aarestrup F.M., Agersø Y. Diversity of the tetracycline resistance gene tet(M) and identification of Tn916- and Tn5801-like (Tn6014) transposons in Staphylococcus aureus from humans and animals. J. Antimicrob. Chemother. 2009; 64(3):490–500. DOI: 10.1093/jac/dkp214.

9. Gnanadhas D.P., Marathe S.A., Chakravortty D. Biocides – resistance, cross-resistance mechanisms and assessment. Expert Opin. Investig. Drugs. 2013; 22(2):191–206. DOI: 10.1517/13543784.2013.748035.

10. Chaplin C.E. Bacterial resistance to quaternary ammonium disinfectants. J. Bacteriol. 1952; 63(4):453–8. DOI: 10.1128/jb.63.4.453-458.1952.

11. Merchel Piovesan Pereira B., Tagkopoulos I. Benzalkonium chlorides: uses, regulatory status, and microbial resistance. Appl. Environ. Microbiol. 2019; 85(13):e00377-19. DOI: 10.1128/AEM.00377-19.

12. Кобзев Е.Н., Чугунов В.А., Родин В.Б., Детушева Е.В., Слукин П.В., Фёдорова Л.С., Акимкин В.Г. Формирование устойчивости микроорганизмов к дезинфицирующим средствам и пути решения проблемы. Эпидемиология и инфекционные болезни. 2014; 19(6):48–54.

13. Ahn Y., Kim J.M., Lee Y.J., LiPuma J., Hussong D., Marasa B., Cerniglia C. Effects of extended storage of chlorhexidine gluconate and benzalkonium chloride solutions on the viability of Burkholderia cenocepacia. J. Microbiol. Biotechnol. 2017; 27(12):2211–20. DOI: 10.4014/jmb.1706.06034.

14. Kampf G. Adaptive microbial response to low-level benzalkonium chloride exposure. J. Hosp. Infect. 2018; 100(3):e1-e22. DOI: 10.1016/j.jhin.2018.05.019.

15. Лучинин Д.Н., Молчанова Е.В., Захарова И.Б., Викторов Д.В. Анализ резистентности у Burkholderia pseudomallei к бензалкония хлориду и антибиотикам. Проблемы особо опасных инфекций. 2022; 3:115–9. DOI: 10.21055/0370-1069-2022-3-115-119.

16. Babraham Bioinformatics – Andrews S. FastQC: A quality control tool for high throughput sequence data. [Электронный ресурс]. URL: http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/.

17. Ewels P., Magnusson M., Lundin S., Käller M. MultiQC: summarize analysis results for multiple tools and samples in a single report. Bioinformatics. 2016; 32(19):3047–8. DOI: 10.1093/bioinformatics/btw354.

18. Bankevich A., Nurk S., Antipov D., Gurevich A.A., Dvorkin M., Kulikov A.S., Lesin V.M., Nikolenko S.I., Pham S., Prjibelski A.D., Pyshkin A.V., Sirotkin A.V., Vyahhi N., Tesler G., Alekseyev M.A., Pevzner P.A. SPAdes: a new genome assembly algorithm and its applications to single-cell sequencing. J. Comput. Biol. 2012; 19(5):455–77. DOI: 10.1089/cmb.2012.0021.

19. Snippy. [Электронный ресурс]. URL: https://github.com/tseemann/snippy (дата обращения 10.07.2023).

20. Cuthbertson L., Nodwell J.R. The TetR family of regulators. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 2013; 77(3):440–75. DOI: 10.1128/MMBR.00018-13.

21. Ramos J.L., Martínez-Bueno M., Molina-Henares A.J., Terán W., Watanabe K., Zhang X., Gallegos M.T., Brennan R., Tobes R. The TetR family of transcriptional repressors. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 2005; 69(2):326–56. DOI: 10.1128/MMBR.69.2.326-356.2005.

22. Colclough A.L., Scadden J., Blair J.M.A. TetR-family transcription factors in Gram-negative bacteria: conservation, variation and implications for efflux-mediated antimicrobial resistance. BMC Genomics. 2019; 20(1):731. DOI: 10.1186/s12864-019-6075-5.

23. Viktorov D.V., Zakharova I.B., Podshivalova M.V., Kalinkina E.V., Merinova O.A., Ageeva N.P., Antonov V.A., Merinova L.K., Alekseev V.V. High-level resistance to fluoroquinolones and cephalosporins in Burkholderia pseudomallei and closely related species. Trans. R. Soc. Trop. Med. Hyg. 2008; 102(Suppl. 1):103–10. DOI: 10.1016/S0035-9203(08)70025-7.

24. Maseda H., Hashida Y., Konaka R., Shirai A., Kourai H. Mutational upregulation of a resistance-nodulation-cell divisiontype multidrug efflux pump, SdeAB, upon exposure to a biocide, cetylpyridinium chloride, and antibiotic resistance in Serratia marcescens. Antimicrob. Agents Chemother. 2009; 53(12):5230–5. DOI: 10.1128/AAC.00631-09.

25. Begic S., Worobec E.A. The role of the Serratia marcescens SdeAB multidrug efflux pump and TolC homologue in fluoroquinolone resistance studied via gene-knockout mutagenesis. Microbiology (Reading). 2008; 154(Pt. 2):454–61. DOI: 10.1099/mic.0.2007/012427-0. Erratum in: Microbiology. 2009; 155(Pt. 6):2109–11.

26. Chodkowski J.L., Shade A. A coevolution experiment between Flavobacterium johnsoniae and Burkholderia thailandensis reveals parallel mutations that reduce antibiotic susceptibility. Microbiology (Reading). 2023; 169(2):001267. DOI: 10.1099/mic.0.001267.

27. Podnecky N.L., Rhodes K.A., Schweizer H.P. Efflux pump-mediated drug resistance in Burkholderia. Front. Microbiol. 2015; 6:305. DOI: 10.3389/fmicb.2015.00305.