Гибридная сборка полных геномов штаммов Yersinia pestis

Цель исследования – сборка полноразмерных нуклеотидных последовательностей хромосомы и плазмид для 13 штаммов Yersinia pestis из 11 природных очагов чумы, находящихся на территории Российской Федерации, используя данные двух технологий секвенирования.

Материалы и методы. Штаммы Y. pestis выращивали на агаре Хоттингера (рН 7,2) при 37 °С. Выделение ДНК проводили методом фенол-хлороформной экстракции. Для генетического анализатора MinIon (Oxford Nanopore) подготовку ДНК-фрагметов проводили методом лигирования по модифицированному протоколу. Для генетического анализатора Ion S5 (IonTorrent) подготовку образцов проводили по стандартному протоколу получения библиотеки с размером фрагментов ДНК 400 пар нуклеотидов (п.н.). Полученные единичные прочтения отфильтровывались по среднему качеству Q30 для IonTorrent и Q7 для Oxford Nanopore.

Результаты и обсуждение. Проведена подготовка фрагментов ДНК, содержащих 50000 и более пар нуклеотидов, для последующего секвенирования с использованием технологии секвенирования через нанопоры (Oxford Nanopore). Использован алгоритм Trycycler для гибридной сборки генома штаммов Y. pestis и коррекции возникающих при этом процессе ошибок, позволяющий собрать полноразмерные нуклеотидные последовательности хромосомы и плазмид для каждого генома штамма. В международную генетическую базу данных NCBI GenBank депонированы нуклеотидные последовательности хромосом геномов 13 штаммов Y. pestis из 11 природных очагов чумы, находящихся на территории Российской Федерации. Установлено, что для сборки полноразмерных геномов штаммов Y. pestis необходимо значительное количество прочтений размером 50000 п.н. и более, а использование алгоритма Trycycler позволяет получить более точную сборку полных геномов бактерий.

1. Hu T., Chitnis N., Monos D., Dinh A. Next-generation sequencing technologies: An overview. Hum. Immunol. 2021; 82(11):801–11. DOI: 10.1016/j.humimm.2021.02.012.

2. Oxford Nanopore Technologies. (Cited 16 Nov 2023). [Internet]. Available from: https://nanoporetech.com/applications.

3. Wick R.R., Judd L.M., Cerdeira L.T., Hawkey J., Méric G., Vezina B., Wyres K.L., Holt K.E. Trycycler: consensus long-read assemblies for bacterial genomes. Genome Biol. 2021; 22(1):266. DOI: 10.1186/s13059-021-02483-z.

4. Wick R.R., Judd L.M., Holt K.E. Assembling the perfect bacterial genome using Oxford Nanopore and Illumina sequencing. PLoS Comput. Biol. 2023; 19(3):e1010905. DOI: 10.1371/journal.pcbi.1010905.

5. Krøvel A.V., Hetland M.A.K., Bernhoff E., Bjørheim A.S., Soma M.A., Löhr I.H. Long-read sequencing for reliably calling the mompS allele in Legionella pneumophila sequence-based typing. Front. Cell. Infect. Microbiol. 2023; 13:1176182. DOI: 10.3389/fcimb.2023.1176182.

6. Martino J.A., Fernandez F.D., Pozzi E.A., Alberione E., Bainotti C., Marquez N., Tolocka P.A., Salines N., Gomez D., Donaire G., Conci L., Alemandri V.M. First report of Xanthomonas prunicola causing bacterial leaf streaks on wheat in Argentina. Plant Dis. 2022. DOI: 10.1094/PDIS-04-22-0886-PDN.

7. Kolmogorov M., Yuan J., Lin Y., Pevzner P.A. Assembly of long error-prone reads using repeat graphs. Nat. Biotechnol. 2019; 37(5):540–6. DOI: 10.1038/s41587-019-0072-8.

8. Vaser R., Šikić M. Raven: a de novo genome assembler for long reads. bioRxiv. 2021. DOI: 10.1101/2020.08.07.242461.

9. Chen Z., Erickson D.L., Meng J. Benchmarking Long- Read Assemblers for genomic analyses of bacterial pathogens using Oxford Nanopore sequencing. Int. J. Mol. Sci. 2020; 21(23):9161. DOI: 10.3390/ijms21239161.

10. Li H. Minimap and miniasm: fast mapping and de novo assembly for noisy long sequences. Bioinformatics. 2016; 32(14), 2103–10. DOI: 10.1093/bioinformatics/btw152.

11. Jung H., Jeon M.S., Hodgett M., Waterhouse P., Eyun S.I. Comparative evaluation of genome assemblers from long-read sequencing for plants and crops. J. Agric. Food Chem. 2020; 68(29):7670–7. DOI: 10.1021/acs.jafc.0c01647.

12. Ondov B.D., Treangen T.J., Melsted P., Mallonee A.B., Bergman N.H., Koren S., Phillippy A.M. Mash: fast genome and metagenome distance estimation using MinHash. Genome Biol. 2016; 17(1):132. DOI: 10.1186/s13059-016-0997-x.

13. Criscuolo A. On the transformation of MinHash-based uncorrected distances into proper evolutionary distances for phylogenetic inference. F1000Res. 2020; 9:1309. DOI: 10.12688/f1000research.26930.1.

14. Sequence correction provided by ONT Research. (Cited 24 Oct 2023). [Internet]. Available from: https://github.com/nanoporetech/medaka.

15. Walker B.J., Abeel T., Shea T., Priest M., Abouelliel A., Sakthikumar S., Cuomo C.A., Zeng Q., Wortman J., Young S.K., Earl A.M. Pilon: An integrated tool for comprehensive microbial variant detection and genome assembly improvement. PLoS One. 2014; 9(11):e112963, DOI: 10.1371/journal.pone.0112963.

16. Wick R.R., Judd L.M., Gorrie C.L., Holt K.E. Unicycler: Resolving bacterial genome assemblies from short and long sequencing reads. PLoS Comput. Biol. 2017; 13(6):e1005595. DOI: 10.1371/journal.pcbi.1005595.

17. Farrow J.M. 3rd, Pesci E.C., Slade D.J. Genome sequences for two Acinetobacter baumannii strains obtained using the unicycler hybrid assembly pipeline. Microbiol. Resour. Announc. 2021; 10(10):e00017-21. DOI: 10.1128/MRA.00017-21.

18. Simão F.A., Waterhouse R.M., Ioannidis P., Kriventseva E.V., Zdobnov E.M. BUSCO: assessing genome assembly and annotation completeness with single-copy orthologs. Bioinformatics. 2015; 31(19):3210–2. DOI: 10.1093/bioinformatics/btv351.

19. Manni M., Berkeley M.R., Seppey M., Zdobnov E.M. BUSCO: Assessing genomic data quality and beyond. Curr. Protoc. 2021; 1(12):e323. DOI: 10.1002/cpz1.323.

20. Indels are not ideal – quick test for interrupted ORFs in bacterial/microbial genomes. (Cited 08 Jul 2023). [Internet]. Available from: https://github.com/mw55309/ideel.

21. Peng Y., Cai X., Li M., Deng L., Wang Y., Qiu Y., Zhao L., Xiao Y., Xu L., Hou Q. The first completed genome of species Prevotella bivia, assembled from a clinically derived strain PLW0727. J. Glob. Antimicrob. Resist. 2023; 35:268–70. DOI: 10.1016/j.jgar.2023.10.009.

22. El-Sabeh A., Mlesnita A.M., Munteanu I.T., Honceriu I., Kallabi F., Boiangiu R.S., Mihasan M. Characterisation of the Paenarthrobacter nicotinovorans ATCC 49919 genome and identification of several strains harbouring a highly syntenic nic-genes cluster. BMC Genomics. 2023; 24(1):536. DOI: 10.1186/s12864-023-09644-3.

23. Ishida-Kuroki K., Hisatsune J., Segawa T., Sugawara Y., Masuda K., Tadera K., Kashiyama S., Yokozaki M., Le M.N., Kawada-Matsuo M., Ohge H., Komatsuzawa H., Sugai M. Complete genome sequence of cfr(B)-carrying Enterococcus raffinosus isolated from bile in a patient in Japan. J. Glob. Antimicrob. Resist. 2023; 34:43–5. DOI: 10.1016/j.jgar.2023.06.004.