Продукция холерного токсина и его локализация в составе везикул геновариантов Vibrio cholerae El Tor

Цель работы – оценить уровень токсинопродукции геновариантов Vibrio cholerae El Tor и определить локализацию холерного токсина в составе везикул.

Материалы и методы. В работе использовали типичные штаммы и геноварианты V. cholerae El Tor, жидкие питательные среды: AKI и среду по прописи J. Hyan, – обеспечивающие высокую токсинопродукцию в условиях аэрации. Обеззараженные супернатанты исследуемых штаммов служили источником выделения препаратов холерного токсина и мембранных везикул. Определение локализации холерного токсина (ХТ), внутри или на внешней поверхности везикул, осуществляли с помощью различных методов: ПААГ-электрофорез, иммуноблот, GM1-ИФА, непрямой неконкурентный ИФА, модель культуры клеток CHO-K1, HuTu 80.

Результаты и обсуждение. Из супернатантов типичного и геновариантов V. cholerae El Tor, обладающих высоким уровнем токсинопродукции, выделены препараты везикул, содержащие в своем составе холерный токсин. После разделения везикул с помощью ПААГ-электрофореза, а затем иммуноблота со специфической антитоксической сывороткой установлено, что холерный токсин сохраняет полную структуру, включая обе субъединицы. В отличие от ХТ, секретируемого в среду культивирования, везикулоассоциированный не связывается как с рецептором GM1 ганглиозидов, сенсибилизированных на планшетах, так и GM1 на клеточных культурах, что свидетельствует об его отсутствии на внешней поверхности везикул. Положительная реакция в GM1-ИФА специфических антитоксических антител с везикулами, после их деградации ЭДТА, предполагает локализацию ХТ в полости везикул. Отсутствие токсина на внешней поверхности везикул у типичных и штаммов геновариантов V. cholerae El Tor исключает его связь с GM1-рецептором и позволяет предположить возможность их проникновения в клетки-мишени GM1-независимым путем. Выбор пути, по которому происходит передача везикулоассоциированного токсина в клетки-хозяева, обусловлен, вероятно, его местонахождением, т.е. связан он с внутренними структурами везикул или локализован на их поверхности.

1. Савельева И.В., Куличенко А.Н., Савельев В.Н., Ковалев Д.А., Таран Т.В., Подопригора Е.И., Васильева О.В., Шапаков Н.А. Холера Эль-Тор на современном этапе седьмой пандемии: эволюция возбудителя, клинико-эпидемиологические особенности, лабораторная диагностика. Инфекция и иммунитет. 2021; 11(5):917–26. DOI: 10.15789/2220-7619-ETC-1476.

2. Dutta S., Iida K., Takade A., Meno Y., Nair G.B., Yoshida S. Release of Shiga toxin by membrane vesicles in Shigella dysenteriae serotype 1 strains and in vitro effects of antimicrobials on toxin production and release. Microbiol. Immunol. 2004; 48(12):965–9. DOI: 10.1111/j.1348-0421.2004.tb03626.x.

3. Rueter C., Bielaszewska M. Secretion and delivery of intestinal pathogenic Escherichia coli virulence factors via outer membrane vesicles. Front. Cell. Infect. Microbiol. 2020; 10:91. DOI: 10.3389/fcimb.2020.0009106.

4. Parker H., Chitcholtan K., Hampton M.B., Keenan J.I. Uptake of Helicobacter pylori outer membrane vesicles by gastric epithelial cells. Infect. Immun. 2010; 78(12):5054–61. DOI: 10.1128/IAI.00299-10.

5. Caruana J.C., Walper S.A. Bacterial membrane vesicles as mediators of microbe – microbe and microbe – host community interactions. Front. Microbiol. 2020; 11:432. DOI: 10.3389/fmicb.2020.00432.

6. Bitar A., Aung K.M., Wai S.N., Hammarström M.-L. Vibrio cholerae derived outer membrane vesicles modulate the inflammatory response of human intestinal epithelial cells by inducing microRNA-146a. Sci. Rep. 2019; 9(1):7212. DOI: 10.1038/s41598-019-43691-9.

7. Rasti E.S., Schappert M.L., Brown A.C. Association of Vibrio cholerae 569B outer membrane vesicles with host cells occurs in GM1-independent manner. Cell. Microbiol. 2018; 20(6):e12828. DOI: 10.1111/cmi.12828.

8. Rasti E.S., Brown AC. Cholera toxin encapsulated within several Vibrio cholerae O1 serotype Inaba outer membrane vesicles lacks a functional B-subunit. Toxins (Basel). 2019; 11(4):207. DOI: 10.3390/toxins11040207.

9. Iwanaga M., Kuyyakanond Т. Large production of cholera toxin by Vibrio cholerae O1 in yeast extract peptone water. J. Clin. Microbiol. 1987; 25(12):2314–6. DOI: 10.1128/jcm.25.12.2314-2316.1987.

10. Jang H., Kim H.S., Kim J.A., Seo J.H., Carbis R. Improved purification process for cholera toxin and its application to the quantification of residual toxin in cholera vaccines. J. Microbiol. Biotechnol. 2009; 19(1):108–12.

11. Кудрякова И.В., Сузина Н.Е., Винокурова Н.Г., Шишкова Н.А., Васильева Н.В. Изучение факторов биогенеза везикул Lysobacter sp. XL1. Биохимия. 2017; 82(4):677–86.

12. Sack D.A., Huda S., Neogi P.K., Daniel R.R., Spira W.M. Microtiter ganglioside enzyme-linked immunosorbent assay for Vibrio and Escherichia coli heat-labile enterotoxins and antitoxins. J. Clin. Microbiol. 1980; 11(1):35–45. DOI: 10.1128/jcm.11.1.35-40.1980.

13. Алексеева Л.П., Якушева О.А., Зюзина В.П., Дуванова О.В., Шипко Е.С., Писанов Р.В. Современные методические приемы очистки холерного токсина. Вестник биотехнологии и физико-химической биологии им. Ю.А. Овчинникова. 2019; 15(1):5–9.

14. Фрешни Р.Я. Культура животных клеток. Практическое руководство. М.: Лаборатория знаний; 2018. 691 с.

15. Laemmli U.K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 1970; 227(5259):680–5. DOI: 10.1038/227680a0.

16. Towbin H., Gordon J. Immunoblotting and dotimmunoblotting – current status and outlook. J. Immunol. Methods. 1984; 72(2):313–40. DOI: 10.1016/0022-1759(84)90001-2.

17. Klimentová J., Stulík J. Methods of isolation and purification of outer membrane vesicles from gram-negative bacteria. Microbiol. Res. 2015; 170:1–9. DOI: 10.1016/j.micres.2014.09.006.

18. Заднова С.П., Крицкий А.А., Плеханов Н.А., Челдышова Н.Б., Смирнова Н.И. Сравнительный анализ адаптационных свойств типичных генетически измененных штаммов Vibrio cholerae биовара El Tor. Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. 2019; 2:25–30. DOI: 10.36233/0372-9311-2019-2-25-30.

19. Chinnapen D.J.-F., Chinnapen H., Saslowsky D., Lencer W.I. Rafting with cholera toxin: endocytosis and trafficking from plasma membrane to ER. FEMS Microbiol. Lett. 2007; 266(2):129–37. DOI: 10.1111/j.1574-6968.2006.00545.х.

20. Rewatkar P.V., Parton R.G., Parekh H.S., Parat M.-O. Are caveolae a cellular entry route for non-viral therapeutic delivery systems? Adv. Drug Deliv. Rev. 2015; 91:92–108. DOI: 10.1016/j.addr.2015.01.003.

21. El-Sayed A., Harashima H. Endocytosis of gene delivery vectors: from clathrin-dependent to lipid raft-mediated endocytosis. Mol. Ther. 2013; 21(6):1118–30. DOI: 10.1038/mt.2013.54.

22. O’Donoghue E.J., Krachler A.M. Mechanisms of outer membrane vesicle entry into host cells. Cell. Microbiol. 2016; 18(11):1508–17. DOI: 10.1111/cmi.12655.

23. Zingl F.G., Thapa H.B., Scharf M., Kohl P., Müller A.M., Schild S. Outer membrane vesicles of Vibrio cholerae protect and deliver active cholera toxin to host cells via porin-dependent uptake. mBio. 2021; 12(3):е0053421. DOI: 10.1128/mBio.00534-21.