Характеристика CTX⁺ штамма Vibrio cholerae O1, выделенного в 2023 г. из реки Темерник в Ростове-на-Дону

Цель работы – определение фено- и генотипических особенностей CTX+ штамма Vibrio cholerae, выделенного в 2023 г. из пробы воды, и сравнительный биоинформационный анализ данных полногеномного секвенирования.

Материалы и методы. Полногеномное секвенирование выполняли на платформах MiSeq (Illumina) и MinIon (Oxford Nanopore Technologies), гибридную сборку полного генома проводили с использованием алгоритма Trycycler, устранение ошибок сборки – с помощью алгоритма Medaka и программы Pilon. Построение дендрограммы и биоинформационный анализ осуществляли с использованием пакетов SciPy и Graphviz, программ BioEdit, BLASTN, BLASTP, CARD, ICE Genotyper, Vector NTI. Способность к токсинопродукции проверяли с помощью иммуноферментного анализа GM1ИФА.

Результаты и обсуждение. Выделенный штамм идентифицирован как V. cholerae О1 Огава, чувствительный к большинству антибиотиков. По совокупности генетических свойств он отнесен к первым геновариантам, отличающимся от типовых штаммов Эль Тор только наличием гена ctxB1 классического типа вместо ctxB3 типа Эль Тор. Установлено, что он содержит тандемно дуплицированный профаг СТХ в составе малой хромосомы и тандем из двух копий профага RS1 в составе большой. При этом ген rstR профага СТХ относился к классическому типу, а профага RS1 – к типу Эль Тор. Остальные критерии эпидемической опасности – tcpA^elt, rtxA1 и интактный VSP-II – не отличались от прототипов. В геноме штамма обнаружен ICE-элемент VchBan11, содержащий ген устойчивости к триметоприму dfrA1, и фенотипически штамм устойчив к этому антибиотику. В условиях in vitro штамм не продуцировал холерный токсин, как показали результаты ИФА. Возможно, это связано с наличием делеции в регуляторном гене toxR. Штаммы, подобные изоляту 2023 г., относят в основном ко второй волне седьмой пандемии. В настоящее время они практически вытеснены новыми геновариантами, но изредка могут встречаться и даже вызывать заболевания. Поэтому их заносы на территорию России потенциально могут представлять угрозу здоровью населения.

1. Ежова М.И., Левченко Д.А., Архангельская И.В., Кругликов В.Д., Непомнящая Н.Б. Особенности биологических свойств Vibrio cholerae, изолированных в процессе мониторинга водных объектов Ростова-на-Дону с 1989 по 2018 год. Проблемы особо опасных инфекций. 2021; 1:148–51. DOI: 10.21055/0370-1069-2021-1-148-151.

2. Monakhova E.V., Ghosh A., Mutreja A., Weill F.-X., Ramamurthy T. Endemic cholera in India and imported cholera in Russia: what is common? Problemy Osobo Opasnykh Infektsii [Problems of Particularly Dangerous Infections]. 2020; 3:17–26. DOI: 10.21055/0370-1069-2020-3-17-26.

3. Водопьянов С.О., Водопьянов А.С., Олейников И.П., Монахова Е.В. Разработка схемы типирования токсигенных холерных вибрионов на основе данных биоинформационного анализа. Здоровье населения и среда обитания. 2022; 30(7):66–71. DOI: 10.35627/2219-5238/2022-30-7-66-71.

4. Iwanaga M., Kuyyakanond T. Large production of cholera toxin by Vibrio cholerae O1 in yeast extract peptone water. J. Clin. Microbiol. 1987; 25(1):2314–16. DOI: 10.1128/jcm.25.12.2314-2316.1987.

5. Sack D.A., Huda S., Neogi P.K., Daniel R.R., Spira W.M. Microtiter ganglioside enzyme linked immunosorbent assay for Vibrio and Escherichia coli heat labile enterotoxins and antitoxin. J. Clin. Microbiol. 1980; 11(1):35–40. DOI: 10.1128/jcm.11.1.35-40.1980.

6. Wick R.R., Judd L.M., Cerdeira L.T., Hawkey J., Meric G., Vezina B., Wyres K.L., Holt K.E. Trycycler: consensus long-read assemblies for bacterial genomes. Genome Biol. 2021; 22(1):266. DOI: 10.1186/s13059-021-02483-z.

7. Wick R.R., Judd L.M., Holt K.E. Assembling the perfect bacterial genome using Oxford Nanopore and Illumina sequencing. PLoS Comput. Biol. 2023; 19(3):e1010905. DOI: 10.1371/journal.pcbi.1010905.

8. Sequence correction provided by ONT research. [Электронный ресурс]. URL: https://github.com/nanoporetech/medaka (дата обращения 24.10.2023).

9. Walker B.J., Abeel T., Shea T., Priest M., Abouelliel A., Sakthikumar S., Cuomo C.A., Zeng Q., Wortman J., Young S.K., Earl A.M. Pilon: an integrated tool for comprehensive microbial variant detection and genome assembly improvement. PLoS One. 2014; 9(11):e112963. DOI: 10.1371/journal.pone.0112963.

10. Монахова Е.В., Водопьянов А.С., Кругликов В.Д., Селянская Н.А., Писанов Р.В., Носков А.К. Молекулярногенетическая характеристика штаммов Vibrio cholerae nonO1/nonO139, выделенных от больных отитами на территории Российской Федерации. Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. 2022; 99(4):465–77. DOI: 10.36233/0372-9311-215.

11. Bankevich A., Nurk S., Antipov D., Gurevich A.A., Dvorkin M., Kulikov A.S., Lesin V.M., Nikolenko S.I., Pham S., Prjibelski A.D., Pyshkin A.V., Sirotkin A.V., Vyahhi N., Tesler G., Alekseyev M.A., Pevzner P.A. SPAdes: a new genome assembly algorithm and its applications to single-cell sequencing. J. Comput. Biol. 2012; 19(5):455–77. DOI: 10.1089/cmb.2012.0021.

12. Водопьянов А.С., Писанов Р.В., Водопьянов С.О., ОлейниковИ.П. Совершенствованиеметодики SNP-типирования штаммов Vibrio cholerae на основе анализа первичных данных полногеномного секвенирования. Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. 2020; 97(6):587–93. DOI: 10.36233/0372-9311-2020-97-6-9.

13. Virtanen P., Gommers R., Oliphant T.E., Haberland M., Reddy T., Cournapeau D., Burovski E., Peterson P., Weckesser W., Bright J., van der Walt S.J., Brett M., Wilson J., Millman K.J., Mayorov N., Nelson A.R.J., Jones E., Kern R., Larson E., Carey C.J., Polat İ., Feng Y., Moore E.W., VanderPlas J., Laxalde D., Perktold J., Cimrman R., Henriksen I., Quintero E.A., Harris C.R., Archibald A.M., Ribeiro A.H., Pedregosa F., van Mulbregt P.; SciPy 1.0 Contributors. SciPy 1.0: fundamental algorithms for scientific computing in Python. Nat. Methods. 2020; 17(3):261–72. DOI: 10.1038/s41592-019-0686-2.

14. Ellson J., Gansner E., Koutsofios L., North S.C., Woodhull G. Graphviz – open source graph drawing tools. In: Mutzel P., Jünger M., Leipert S., editors. Graph Drawing. 9th international symposium, GD 2001. Vienna, Austria, September 23–26, 2001. Berlin, Heidelberg: Springer; 2002. P. 483–85. DOI: 10.1007/3-540-45848-4_57.

15. Водопьянов А.С., Водопьянов С.О., Писанов Р.В. «V. cholerae ICE Genotyper» – программа для выявления и типирования интегративно-конъюгативного элемента у штаммов V. cholerae. Свидетельство о государственной регистрации от 21.06.2023 № 2023663855. [Электронный ресурс]. URL: https://antiplague.ru/v-cholerae-ice-genotyper-programma-dlya-vyyavleniya-i-tipirovaniya-integrativno-konyugativnogo-elementa-ice-elementa-u-shtammov-v-cholerae.

16. Mutreja A., Kim D.W., Thomson N.R., Connor T.R., Lee J.H., Kariuki S., Croucher N.J., Choi S.Y., Harris S.R., Lebens M., Niyogi S.K., Kim E.J., Ramamurthy T., Chun J., Wood J.L., Clemens J.D., Czerkinsky C., Nair G.B., Holmgren J., Parkhill J., Dougan G. Evidence for several waves of global transmission in the seventh cholera pandemic. Nature. 2011; 477(7365):462–5. DOI: 10.1038/nature10392.

17. Ramamurthy T., Mutreja A., Weill F.-X., Das B., Ghosh A., Nair G.B. Revisiting the global epidemiology of cholera in conjunction with the genomics of Vibrio cholerae. Front. Public Health. 2019; 7:203. DOI: 10.3389/fpubh.2019.00203.

18. Choi S.Y., Lee J.H., Kim E.J., Lee H.R., Jeon Y.S., von Seidlein L., Deen J., Ansaruzzaman M., Lucas G.M.E.S., Barreto A., Songane F.F., Mondlane C., Nair G.B., Czerkinsky C., Clemens J.D., Chun J., Kim D.W. Classical RS1 and environmental RS1 elements in Vibrio cholerae O1 El Tor strains harbouring a tandem repeat of CTX prophage: revisiting Mozambique in 2005. J. Med. Microbiol. 2010; 59(Pt. 3):302–8. DOI: 10.1099/jmm.0.017053-0.

19. Ha S.-M., Chalita M., Yang S.-J., Yoon S.-H., Cho K., Seong W.K., Hong S., Kim J., Kwak H.-S., Chun J. Comparative genomic analysis of the 2016 Vibrio cholerae outbreak in South Korea. Front. Public Health. 2019; 7:228. DOI: 10.3389/fpubh.2019.00228.

20. Baddam R., Sarker N., Ahmed D., Mazumder R., Abdullah A., Morshed R., Hussain A., Begum S., Shahrin L., Khan A.I., Islam M.S., Ahmed T., Alam M., Clemens J.D., Ahmed N. Genome dynamics of Vibrio cholerae isolates linked to seasonal outbreaks of cholera in Dhaka, Bangladesh. mBio. 2020; 11(1):e03339-19. DOI: 10.1128/mBio.03339-19.

21. Смирнова Н.И., Агафонов Д.А., Щелканова Е.Ю., Рыбальченко Д.А., Крицкий А.А., Альхова Ж.В., Краснов Я.М., Агафонова Е.Ю., Кутырев В.В. Структурные и функциональные изменения генома авирулентных штаммов Vibrio cholerae биовара Эль Тор ctxA+tcpA+. Молекулярная генетика, микробиология и вирусология. 2020; 38(3):108–19. DOI: 10.17116/molgen202038031108.

22. Шашкова А.В., Агафонов Д.А., Черкасов А.В., Заднова С.П., Смирнова Н.И. Фенотипический и молекулярногенетический анализ генетически измененного токсигенного штамма Vibrio cholerae 301 биовара эльтор, изолированного в 2011 году в России. Проблемы особо опасных инфекций. 2012; 4:61–4. DOI: 10.21055/0370-1069-2012-4-61-64.

23. Писанов Р.В., Ежова М.И., Монахова Е.В., Черкасов А.В., Краснов Я.М., Водопьянов А.С., Кульшань Т.А., Ливанова Л.Ф., Портенко С.А., Абдрашитова А.С., Кругликов В.Д., Титова С.В. Особенности структуры генома токсигенного штамма Vibrio cholerae El Tor Инаба, выделенного в 2014 г. из открытого водоема в Ростове-на-Дону. Проблемы особо опасных инфекций. 2015; 2:63–7. DOI: 10.21055/0370-1069-2015-2-63-67.

24. Goss T.J., Morgan S.J., French E.L., Krukonis E.S. ToxR recognizes a direct repeat element in the toxT, ompU, ompT, and ctxA promoters of Vibrio cholerae to regulate transcription. Infect. Immun. 2013; 81(3):884–95. DOI: 10.1128/IAI.00889-12.

25. Dorman M.J., Dorman C.J. Regulatory hierarchies controlling virulence gene expression in Shigella flexneri and Vibrio cholerae. Front. Microbiol. 2018; 9:2686. DOI: 10.3389/fmicb.2018.02686.

26. Morgan S.J., French E.L., Plecha S.C., Krukonis E.S. The wing of the ToxR winged helix-turn-helix domain is required for DNA binding and activation of toxT and ompU. PLoS One. 2019; 14(9):e0221936. DOI: 10.1371/journal.pone.0221936.

27. Stone J.B., Withey J.H. H-NS and ToxT inversely control cholera toxin production by binding to overlapping DNA sequences. J. Bacteriol. 2021; 203(18):e0018721. DOI: 10.1128/JB.00187-21.

28. Naha A., Withey J.H., Mukherjee P., Saha R.N., Samanta P., Ghosh A., Miyoshi S.I., Dutta S., Mukhopadhyay A.K. Elucidating the correlation between the number of TTTTGAT heptamer repeats and cholera toxin promoter activity in Vibrio cholerae O1 pandemic strains. FEMS Microbiol. Lett. 2022; 369(1):fnac041. DOI: 10.1093/femsle/fnac041.

29. Gladkikh A.S., Feranchuk S.I., Ponomareva A.S., Bochalgin N.O., Mironova L.V. Antibiotic resistance in Vibrio cholerae El Tor strains isolated during cholera complications in Siberia and the Far East of Russia. Infect. Genet. Evol. 2020; 78:104096. DOI: 10.1016/j.meegid.2019.104096.

30. Sarkar A., Morita D., Ghosh A., Chowdhury G., Mukhopadhyay A.K., Okamoto K., Ramamurthy T. Altered integrative and conjugative elements (ICEs) in recent Vibrio cholerae O1 isolated from cholera cases, Kolkata, India. Front. Microbiol. 2019; 10:2072. DOI: 10.3389/fmicb.2019.02072.