Внутривидовая дифференциация штаммов Francisella tularensis с помощью молекулярно-генетических методов. Комплексный подход

Цель исследования – разработка алгоритма внутривидовой дифференциации штаммов возбудителя туляремии с использованием комплекса подходов, основанных на амплификационных и секвенационных технологиях.

Материалы и методы. В работе использовали 97 штаммов Francisella tularensis различных подвидов, биоваров и субпопуляций. Внутривидовую принадлежность штаммов возбудителя туляремии осуществляли с использованием системы «F. tularensis-4c», анализа вариабельности области дифференциации RD1, гена sdhA, дискодиффузионным методом с использованием дисков с эритромицином. Фрагментное секвенирование по Сэнгеру осуществляли на генетическом анализаторе 3500 XL (Applied Biosystems, США) с учетом рекомендаций производителя. Оценку гомологии последовательностей – по алгоритму BLAST, используя базу данных GenBank NCBI, программы MEGA11 v11.0.13 и Unipro UGENE v50.0.

Результаты и обсуждение. Выявлены подвидо- и биовароспецифичные мутации в гене 23S рРНК. Определены перспективные для изучения участки данного гена с помощью фрагментного секвенирования. Предложена комплексная схема внутривидовой дифференциации штаммов туляремийного микроба, где на первом этапе проводится определение подвидовой принадлежности и биовара japonica, а на втором – верификация полученных результатов на основании определения мутаций в гене 23S рРНК. Эффективность предложенного комплексного подхода подтверждена при исследовании 97 коллекционных штаммов возбудителя туляремии. Проведенные исследования позволяют осуществить быструю идентификацию штаммов разных подвидов туляремийного микроба и верифицировать их таксономическую принадлежность с помощью молекулярно-генетических методов, дополняют данные о циркуляции различных подвидов, биоваров и субпопуляций патогена на территории Европы, Азии и других регионов мира.

1. Олсуфьев Н.Г. Таксономия, микробиология и лабораторная диагностистика возбудителя туляремии. М.: Медицина; 1975. 190 с.

2. List of Procariotic Names with Standing in Nomenclature (LPSN). [Электронный ресурс]. URL: http://www.bacterio.net/francisella.html (дата обращения 15.02.2024).

3. Molins-Schneekloth C.R., Belisle J.T., Petersen J.M. Genomic markers for differentiation of Francisella tularensis subsp. tularensis A.I and A.II strains. Appl. Environmental. Microbiol. 2008; 74(1):336–41. DOI: 10.1128/AEM.01522-07.

4. Tomaso H., Scholz H.C., Neubauer H., Al Dahouk S., Seibold E., Landt O., Forsman M., Splettstoesser W.D. Real-time PCR using hybridization probes for the rapid and specific identification of Francisella tularensis subspecies tularensis. Mol. Cell. Probes. 2007; 21(1):12–6. DOI: 10.1016/j.mcp.2006.06.001.

5. WHO. Guidelines on Tularaemia. WHO Press; 2007. 115 p.

6. Broekhuijsen M., Larsson P., Johansson A., Byström M., Eriksson U., Larsson E., Prior R.G., Sjöstedt A., Titball R.W., Forsman M. Genome-wide DNA microarray analysis of Francisella tularensis strains demonstrates extensive genetic conservation within the species but identifies regions that are unique to the highly virulent F. tularensis subsp. tularensis. J. Clin. Microbiol. 2003; 41(7):2924– 31. DOI: 10.1128/JCM.41.7.2924-2931.2003.

7. Осина Н.А., Ситмбетов Д.А., Булгакова Е.Г., Чекмарева С.С., Сазанова Е.В., Сеничкина А.М., Ляшова О.Ю., Осин А.В., Щербакова С.А. Внутривидовая дифференциация штаммов Francisella tularensis методом мультилокусной полимеразной цепной реакции с учетом результатов в режиме реального времени. Проблемы особо опасных инфекций. 2023; 1:132–41. DOI: 10.21055/0370-1069-2023-1-132-141.

8. Вахрамеева Г.М., Лапин А.А., Павлов В.М., Мокриевич А.Н., Миронова Р.И., Дятлов И.А. ПЦР-дифференциация подвидов Francisella tularensis с помощью одного праймера. Проблемы особо опасных инфекций. 2011; 1:46–8. DOI: 10.21055/0370-1069-2011-1(107)-46-48.

9. Larson M.A., Sayood K., Bartling A.M., Meyer J.R., Starr C., Baldwin J., Dempsey M.P. Differentiation of Francisella tularensis subspecies and subtypes. J. Clin. Microbiol. 2020; 58(4):e0149519. DOI: 10.1128/JCM.01495-19.

10. Birdsell D.N., Vogler A.J., Buchhagen J., Clare A., Kaufman E., Naumann A., Driebe E., Wagner D.M., Keim P.S. TaqMan realtime PCR assays for single-nucleotide polymorphisms which identify Francisella tularensis and its subspecies and subpopulations. PLoS One. 2014; 9(9):e107964. DOI: 10.1371/journal.pone.0107964.

11. Сорокин В.М., Водопьянов А.С., Цимбалистова М.В., Павлович Н.В. Дифференциация подвидов Francisella tularensis методом INDEL-типирования. Журнал микробиологии, эпидемио¬ логии и иммунологии. 2022; 99(2):193–202. DOI: 10.36233/0372-9311-189.

12. Biswas S., Raoult D., Rolain J.-M. A bioinformatic approach to understanding antibiotic resistance in intracellular bacteria through whole genome analysis. Int. J. Antimicrob. Agents. 2008; 32(3):207–20. DOI: 10.1016/j.ijantimicag.2008.03.017.

13. Тимофеев В.С., Мокриевич А.Н., Павлов В.М. Роль нуклеотидных замен в V домене 23S РНК Francisella tularensis в формировании резистентности туляремийного микроба к эритрмицину. В кн.: Куличенко А.Н., редактор. Актуальные проблемы эпидемиологии и профилактической медицины: Материалы VI Всероссийской научно-практической конференции молодых ученых и специалистов Роспотребнадзора. Ставрополь; 2014. С. 112.

14. Karlsson E., Golovliov I., Lärkeryd A., Granberg M., Larsson E., Öhrman C., Niemcewicz M., Birdsell D., Wagner D.M., Forsman M., Johansson A. Clonality of erythromycin resistance in Francisella tularensis. J. Antimicrob. Chemother. 2016; 71(10):2815–23. DOI: 10.1093/jac/dkw235.

15. Svensson K., Granberg M., Karlsson L., Neubauerova V., Forsman M., Johansson A. A real-time PCR array for hierarchical identification of Francisella isolates. PLoS One. 2009; 4(12):e8360. DOI: 10.1371/journal.pone.0008360.

16. Tamura K., Stecher G., Kumar S. MEGA11: Molecular Evolutionary Genetics Analysis Version 11. Mol. Biol. Evol. 2021; 38(7):3022–27. DOI: 10.1093/molbev/msab120.

17. Okonechnikov K., Golosova O., Fursov M.; UGENE team. Unipro UGENE: a unified bioinformatics toolkit. Bioinformatics. 2012; 28(8):1166–7. DOI: 10.1093/bioinformatics/bts091.

18. Rossow H., Sissonen S., Koskela K.A., Kinnunen P.M., Hemmilä H., Niemimaa J., Huitu O., Kuusi M., Vapalahti O., Henttonen H., Nikkari S. Detection of Francisella tularensis in voles in Finland. Vector Borne Zoonotic Dis. 2014; 14(3):193–8. DOI: 10.1089/vbz.2012.1255.

19. Куделина Р.И., Олсуфьев Н.Г. Чувствительность к антибиотикам группы макролидов и линкомицину возбудителя туляремии голарктической расы. Журнал гигиены, эпидемиологии, микробиологии и иммунологии. 1980; 24(1):84–91.