Особенности везикуляции у вирулентных и авирулентных ЛПС-дефектных штаммов Francisella tularensis различной подвидовой принадлежности

Целью работы явилось сравнительное изучение внеклеточных везикул (OMVs) и их композиционного состава у вирулентных и авирулентных (ЛПС -дефектных) штаммов Fracisella tularensis различной подвидовой принадлежности. Материалы и методы. С помощью трансмиссионной электронной микроскопии изучен процесс везикуляции у бактерий F. tularensis. Полученные препараты OMVs охарактеризованы по композиционному составу иммунологическими методами: реакция нейтрализации антител (РНА т), иммунохроматографический анализ, дот- и иммуноблоттинг. Результаты и обсуждение. Установлено, что все природные вирулентные штаммы, обладающие S-типом липополисахарида (ЛПС ), способны к образованию двух форм везикул: округлых и тубулярных (tubes), специфичных для F. tularensis. У авирулентных ЛПС -дефектных штаммов образование OMVs не зарегистрировано. Выявлено, что везикулы штаммов различных подвидов имеют свои индивидуальные морфологические особенности. Тубулярные структуры среднеазиатского штамма отличались бóльшими размерами по сравнению с голарктическим штаммом. Возможно, именно это определило тот факт, что препараты везикул F. tularensis subsp. mediasiatica, полученные с использованием фильтров с диаметром пор 0,22 мкм были резко обеднены тубулярными формами. Предложен способ обеззараживания суспензий бактерий с помощью гентамицина, не влияющий на морфологию и антигенную активность везикул. При сравнительном изучении нескольких серий концентрированных препаратов OMVs из разных штаммов туляремийного микроба обнаружено, что все образцы обладали антигенной активностью в реакции преципитации по Оухтерлони, РНА т, ИХ -тесте, дот- и иммуноблоттинге. Исследуемые образцы содержали иммунодоминантный антиген – ЛПС и несколько мажорных антигенактивных белков. Выявлены отличия в композиционном составе иммунодоминантных белков везикул, полученных из штаммов разных подвидов туляремийного микроба.

1. Kuehn M.J., Kesty N.C. Bacterial outer membrane vesicles and the host-pathogen interaction. Genes. Dev. 2005; 19(22):2645–55. DOI: 10.1101/gad.1299905.

2. Kulp A., Kuehn M.J. Biological functions and biogenesis of secreted bacterial outer membrane vesicles. Annu. Rev. Microbiol. 2010; 64:163–84. DOI: 10.1146/annurev.micro.091208.073413.

3. Schwechheimer C., Kuehn M.J. Outer-membrane vesicles from gram-negative bacteria: biogenesis and functions. Nat. Rev. Microbiol. 2015; 13(10):605–19. DOI: 10.1038/nrmicro3525.

4. Малкова М.А., Дудина Л.Г., Девришов Д.А., Бывалов А.А. Везикулообразование грамотрицательных бактерий (обзор литературы). Advanced Science. 2017; 4:3.

5. Луста К.А. Бактериальные мембранные внеклеточные нановезикулы: строение, биогенез, функции, использование в биотехнологии и медицине (обзор). Прикладная биохимия и микробиология. 2015; 51(5):443–52. DOI: 10.7868/S0555109915040091.

6. Ellis T.N., Kuehn M.J. Virulence and immunomodulatory roles of bacterial outer membrane vesicles. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 2010; 74(1):81–94. DOI: 10.1128/MMBR.00031-09.

7. Schooling S.R., Beveridge T.J. Membrane vesicles: an overlooked component of the matrices of biofilms. J. Bacteriol. 2006; 188(16):5945–57. DOI: 10.1128/JB.00257-06.

8. Lee E.Y., Choi D.S., Kim K.P., Gho Y.S. Proteomics in gram-negative bacterial outer membrane vesicles. Mass Spectrom. Rev. 2008; 27(6):535–55. DOI: 10.1002/mas.20175.

9. Yoon H. Bacterial outer membrane vesicles as a delivery system for virulence regulation. J. Microbiol. Biotechnol. 2016; 26(8):1343–7. DOI: 10.4014/jmb.1604.04080.

10. Wang S., Gao J., Wang Z. Outer membrane vesicles for vaccination and targeted drug delivery. Wiley Interdiscip. Rev. Nanomed. Nanobiotechnol. 2019; 11(2):e1523. DOI: 10.1002/wnan.1523.

11. Pizza M., Bekkat-Berkani R., Rappuoli R. Vaccines against meningococcal diseases. Microorganisms. 2020; 8(10):1521. DOI: 10.3390/microorganisms8101521.

12. Spidlova P., Stojkova P., Sjöstedt A., Stulik J. Control of Francisella tularensis virulence at gene level: network of transcription factors. Microorganisms. 2020; 8(10):1622. DOI: 10.3390/microorganisms8101622.

13. Jones B.D., Faron M., Rasmussen J.A., Fletcher J.R. Uncovering the components of the Francisella tularensis virulence stealth strategy. Front. Cell. Infect. Microbiol. 2014; 4:32. DOI: 10.3389/fcimb.2014.00032.

14. Rowe H.M., Huntley J.F. From the outside-in: The Francisella tularensis envelope and virulence. Front. Cell. Infect. Microbiol. 2015; 5:94. DOI: 10.3389/fcimb.2015.00094.

15. Ellis J., Oyston C.F., Green M., Titball R.W. Tularemia. Clin. Microbiol. Rev. 2002; 15(4):631–46. DOI: 10.1128/CMR.15.4.631-646.2002.

16. Аронова H.B., Павлович Н.В. Сравнительный анализ иммунного ответа кролика на антигены живых и убитых бактерий рода Francisella. Молекулярная генетика, микробиология и вирусология. 2001; 2:26–30.

17. Sandström G., Sjöstedt A., Johansson T., Kuoppa K., Williams J.C. Immunogenicity and toxicity of lipopolysaccharide from Francisella tularensis LVS. FEMS Microbiol. Immunol. 1992; 5(4):201–10. DOI: 10.1111/j.1574-6968.1992.tb05902.x.

18. Оноприенко Н.Н., Павлович Н.В. Роль липополисахарида в токсичности бактерий рода Francisella. Молекулярная генетика, микробиология и вирусология. 2003; 3:23–9.

19. Pierson T., Matrakas D., Taylor Y.U., Manyam G., Morozov V.N., Zhou W., van Hoek M.L. Proteomic characterization and functional analysis of outer membrane vesicles of Francisella novicida suggests possible role in virulence and use as a vaccine. J. Proteome Res. 2011; 10(3):954–67. DOI: 10.1021/pr1009756.

20. McCaig W.D., Koller А., Thanassi D.G. Production of outer membrane vesicles and outer membrane tubes by Francisella novicida. J. Bacteriol. 2013; 195(6):1120–32. DOI: 10.1128/JB.02007-12.

21. Chen F., Cui G., Wang S., Nair M.K.M., He L., Qi X., Han X., Zhang H., Zhang J.R., Su J. Outer membrane vesicle-associated lipase FtlA enhances cellular invasion and virulence in Francisella tularensis LVS. Emerg. Microbes Infect. 2017; 6(7):е66. DOI: 10.1038/emi.2017.53.

22. Champion A.E., Bandara A.B., Mohapatra N., Fulton K.M., Twine S.M., Inzana T.J. Further characterization of the capsule-like complex (CLC) produced by Francisella tularensis subspecies tularensis: protective efficacy and similarity to outer membrane vesicles. Front. Cell. Infect. Microbiol. 2018; 8:182. DOI: 10.3389/fcimb.2018.00182.

23. Sampath V., McCaig W.D., Thanassi D.G. Amino acid deprivation and central carbon metabolism regulate the production of outer membrane vesicles and tubes by Francisella. Mol. Microbiol. 2018; 107(4):523–41. DOI: 10.1111/mmi.13897.

24. Klimentova J., Pavkova I., Horcickova L., Bavlovic J., Kofronova O., Benada O., Stulik J. Francisella tularensis subsp. Holarctica releases differentially loaded outer membrane vesicles under various stress conditions. Front. Microbiol. 2019; 10:2304. DOI: 10.3389/fmicb.2019.02304.

25. Klimentova J., Rehulka P., Pavkova I., Kubelkova K., Bavlovic J., Stulik J. Cross-species proteomic comparison of outer membrane vesicles and membranes of Francisella tularensis subsp. tularensis versus subsp. holarctica. J. Proteome Res. 2021; 20(3):1716–32. DOI: 10.1021/acs.jproteome.0c00917.

26. Pavkova I., Klimentova J., Bavlovic J., Horcickova L., Kubelkova K., Vlcak E., Raabova H., Filimonenko V., Ballek O., Stulik J. Francisella tularensis outer membrane vesicles participate in the early phase of interaction with macrophages. Front. Microbiol. 2021; 12:748706. DOI: 10.3389/fmicb.2021.748706.

27. Brudal E., Lampe E.O., Reubsaet L., Roos N., Hegna I.K., Thrane I.M., Koppang E.O., Winther-Larsen H.C. Vaccination with outer membrane vesicles from Francisella noatunensis reduces development of francisellosis in a zebrafish model. Fish Shellfish Immunol. 2015; 42(1):50–7. DOI: 10.1016/j.fsi.2014.10.025.

28. Lagos L., Tandberg J.I., Repnik U., Boysen P., Ropstad E., Varkey D., Paulsen I.T., Winther-Larsen H.C. Characterization and vaccine potential of membrane vesicles produced by Francisella noatunensis subsp. orientalis in an adult zebrafish model. Clin. Vaccine Immunol. 2017; 24(5):e00557-16. DOI: 10.1128/CVI.00557-16.

29. Stevenson T.C., Cywes-Bentley C., Moeller T.D., Weyant K.B., Putnam D., Chang Y.F., Jones B.D., Pier G.B., DeLisa M.P. Immunization with outer membrane vesicles displaying conserved surface polysaccharide antigen elicits broadly antimicrobial antibodies. Proc. Natl Acad. Sci. USA. 2018; 115(14):E3106-E3115. DOI: 10.1073/pnas.1718341115.

30. Towbin H., Gordon J. Immunoblotting and dot immunobinding – current status and outlook. J. Immunol. Methods. 1984; 72(2):313–40. DOI: 10.1016/0022-1759(84)90001-2.

31. Laemmli U.K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 1970; 227(5259):680–5. DOI: 10.1038/227680a0.

32. Bavlovic J., Pavkova I., Balonova L., Benada O., Stulik J., Klimentova J. Intact O-antigen is critical structure for the exceptional tubular shape of outer membrane vesicles in Francisella tularensis. Microbiol. Res. 2023; 269:127300. DOI: 10.1016/j.micres.2023.127300.