Штамм Escherichia coli – суперпродуцент гемолизина Vibrio cholerae

Целью работы явилось клонирование гена hlyA Vibrio cholerae в составе плазмидного вектора, обеспечивающего экспрессию чужеродных генов под контролем Т5-промотора, и создание штамма E. coli – суперпродуцента рекомбинантного гемолизина. Материалы и методы. Донором ДНК служил штамм V. cholerae О1, векторной плазмидой – pQE30. Ген амплифицировали с помощью ПЦР, клонирование осуществляли общепринятыми методами, продуктивность рекомбинантов и локализацию искомого белка определяли по результатам электрофореза лизатов клеток. Результаты и выводы. Сконструирована рекомбинантная плазмида pHlyA, экспрессирующая клонированный ген hlyA V. cholerae Эль Тор под контролем Т5-промотора при индукции ИПТГ. Содержащий ее штамм E. coli M15[pREP4]pHlyA является суперпродуцентом гемолизина: количество продукта в лизатах его целых клеток достигает 13 %, а в тельцах включения – 17 % суммарных клеточных белков. Продукт клонированного гена несмотря на отсутствие процессинга и присутствие на N-конце гексагистидинового блока (6His-tag) обладает гемолитической активностью по отношению к эритроцитам барана. Наличие 6His-tag позволит выделять очищенный препарат с помощью специфических сорбентов в целях создания диагностикумов, а также изучения значимости гемолизина как фактора патогенности/персистенции. Преимуществами данного продуцента являются высокий выход искомого белка, отсутствие способности к синтезу каких-либо дополнительных биологически активных субстанций, непродолжительный период наращивания биомассы (4–6 ч включая индукцию) и возможность культивирования без соблюдения режима работы с возбудителями особо опасных инфекций.

гемолизин Vibrio cholerae, клонирование генов, рекомбинантная плазмида, суперпродуцент

1. Власов В.П., Монахова Е.В., Ушакова И.Е., Михась Н.К., Данилкина Е.Б., Ломов Ю.М. Гемолизин Vibrio cholerae eltor: клонирование и экспрессия генов в Escherichia coli. Мол. генет., микробиол. и вирусол. 1992; 7–8:14–20.

2. Монахова Е.В., Писанов Р.В., Гончарова Л.А., Михась Н.К., Непомнящая Н.Б., Асеева Л.Е., Каграманов В.С. Клонирование и экспрессия гена гемагглютинин/протеазы (hapA) Vibrio cholerae в Escherichia coli. Биотехнология. 2006; 6:8–15.

3. Онищенко Г.Г., Кутырев В.В., редакторы. Лабораторная диагностика опасных инфекционных болезней. Практическое руководство. М.: ЗАО «Шико»; 2013. 560 с.

4. Banerjee K.K., Mazumdar B. Vibrio cholerae hemolysin: an enigmatic pore-forming toxin. In: T. Ramamurthy, S.K. Bhattacharya, eds. Epidemiological and molecular aspects on cholera. Springer Science+Business Media; 2011. P. 277–90.

5. Cinar H.N., Kothary M., Datta A.R., Tall B.D., Sprando R., Bilecen K., Yildiz F., McCardell B. Vibrio cholerae hemolysin is required for lethality, developmental delay, and intestinal vacuolation in Caenorhabditis elegans. PLoS One. 2010; 5(7):e11558. DOI: 10.1371/journal.pone.0011558.

6. Goldberg S.L., Murphy J.R. Molecular cloning of the hemolysin determinant from Vibrio cholerae El Tor. J. Bacteriol. 1984; 160(1):239–44.

7. Manning P.A., Brown M.H., Heuzenroeder M.W. Cloning of the structural gene (hly) of Vibrio cholerae El Tor strain 017. Gene. 1984; 31:225–31.

8. Nagamune K., Yamamoto K., Naka A., Matsuyama J., Miwatani T., Honda T. In vitro processing and activation of the recombinant precursor of El Tor cytolysin/hemolysin (pro-HlyA) of Vibrio cholerae by soluble hemagglutinin/protease of V. cholerae, trypsin and other proteases. Infect. Immun. 1996; 64(11):4655–8.

9. Ruenchit P., Reamtong O., Siripanichgon K., Chaicumpa W., Diraphat P. New facet of non-O1/non-O139 Vibrio cholerae hemolysin A: a competitive factor for the environmental niche. FEMS Microbiol. Ecol. 06 Sept 2017. DOI: 10.1093/femsec/fix113. [Epub ahead of print].