Разработка и испытание метода выявления РНК вируса Ласса на основе полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией в режиме реального времени

Цель. Разработка метода выявления и количественного анализа (ОТ-ПЦР в реальном времени) для выявления генетических маркеров вируса Ласса - LASV-Fl. Материалы и методы. Для работы взяты все доступные в базе данных GenBank (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/) последовательности вируса Ласса, которые были выровнены для идентификации консервативных сайтов с использованием программного пакета BioEdit 7.2.5 (IbisBiosciences, США). для апробации разработанного ПЦР-набора была использована контрольная панель РНК вируса Ласса и псевдовирусных частиц, 27 вирусных штаммов, относящихся к различным семействам, а также 37 образцов сывороток крови от пациентов с лихорадочными заболеваниями, отобранных в лечебных учреждениях Республики Гвинея в 2016-2018 гг., и 55 проб суспензий органов от многососковых мышей. Результаты и обсуждение. Аналитическая чувствительность метода варьировала от 10³ до 10⁵ копий/мл и имела 96,4 % диагностическую чувствительность, тогда как аналитическая и диагностическая специфичность составляли 100 %. показано, что разработанная методика может быть успешно применена на практике для обнаружения вируса Ласса в Гвинейской Республике, с использованием различных типов материала от мелких млекопитающих, включая цельную кровь и суспензии органов M. natalensis,а также образцы сывороток крови людей, собранных через 3-7 дней после начала заболевания. Сделано также предположение, что данный метод может быть использован для штаммов вируса Ласса, распространенных не только в Гвинее, но и на других эндемичных территориях, но данный факт необходимо подтвердить в дальнейших исследованиях.

1. Virus taxonomy: the classification and nomenclature of viruses: the online (10th) report of the ICTV [Internet]. (cited 03 Oct 2018). Available from: https://talk.ictvonlme.org/ictv-reports/ictv_onlinereport/.

2. Ogbu O., Ajuluchukwu E., Uneke C.J. Lassa fever in West African sub-region: an overview. J. Vector Borne Dis. 2007; 44(1):1- 11. PMID: 17378212.

3. Safronetz D., Lopez J.E., Sogoba N., Traore’ S.F., Raffel S.J., Fischer E.R., Ebihara H., Branco L., Garry R.F., Schwan T.G., Feldmann H. Detection of Lassa virus, Mali. Emerg. Infect. Dis. 2010; 16(7):1123-6. DOI: 10.3201/eid1607.100146.

4. Ajayi N.A., Nwigwe C.G., Azmogu B.N., Onyire B.N., Nwonwu E.U., Ogbonnaya L.U., Onwe FI., Ekaete T., Gunther S.,Ukwaja K.N. Containing a Lassa fever epidemic in a resource-limited setting: outbreak description and lessons learned from Abakaliki, Nigeria (January-March 2012). Int. J. Infect. Dis. 2013; 17(11):e1011-6. DOI: 10.1016/i.iiid.2013.05.015.

5. Keenlyside R.A., McCormick J.B., Webb P.A., Smith E., Elliott L., Johnson K.M. Case-control study of Mastomys natalensis and humans in Lassa virus-infected households in Sierra Leone. Am. J. Trop. Med. Hyg. 1983; 32: 829-37.

6. Monath T.P., Newhouse V.F., Kemp G.E., Setzer H.W., Cacciapuoti A. Lassa virus isolation from Mastomys natalensis rodents during an epidemic in Sierra Leone. Science. 1974; 185:263-5. PMID: 4833828.

7. Safronetz D., Sogoba N., Lopez J.E., Maiga O., Dahlstrom E., Zivcec M., Feldmann F., Haddock E., Fischer R.J., Anderson J.M., Munster VJ., Branco L., Garry R., Porcella S.F., Schwan T.G., Feldmann H. Geographic distribution and genetic characterization of Lassa virus in sub-Saharan Mali. PLoS Negl. Trop. Dis. 2013; 7(12):e2582. DOI: 10.1371/journal.pntd.0002582.

8. Richmond J.K., Baglole D.J. Lassa fever: epidemiology, clinical features, and social consequences. BMJ. 2003; 327(7426):1271-5. DOI: 10.1136/bmj.327.7426T271.

9. Monath T.P., Mertens P.E., Patton R., Moser C.R., Baum J.J., Pinneo L., Gary G.W., Kissling R.E. A hospital epidemic of Lassa fever in Zorzor, Liberia, March-April 1972. Am. J. Trop. Med. Hyg. 1973; 22(6):773-9. DOI: 10.4269/ajtmh.1973.22.773.

10. Macher A.M., Wolfe M.S. Historical Lassa fever reports and 30-year clinical update. Emerg. Infect. Dis. 2006; 12:835-7. DOI: 10.3201/eid1205.050052.

11. Asogun D.A., Adomeh D.I., Ehimuan J., Odia I., Hass M., Gabriel M., Olschlager S., Becker-Ziaja B., Folarin O., Phelan E., Ehiane P.E., Ifeh V.E., Uyigue E.A., Oladapo Y.T., Muoebonam E.B., Osunde O., Dongo A., Okokhere P.O., Okogbenin S.A., Momoh M., Alikah S.O., Akhuemokhan O.C., Imomeh P., Odike M.A., Gire S., Andersen K., Sabeti PC., Happi C.T., Akpede G.O., Gunther S. Molecular diagnostics for Lassa fever at Irrua specialist teaching hospital, Nigeria: lessons learnt from two years of laboratory operation. PLoS Negl. Trop. Dis. 2012; 6(9):e1839. DOI: 10.1371/journal.pntd.0001839.

12. Olschlager S, Lelke M, Emmerich P, Panning M, Drosten C, Hass M, Asogun D, Ehichioya D, Omilabu S, Gunther S. Improved Detection of Lassa Virus by Reverse Transcription-PCR Targeting the 5’ Region of S RNA. J. Clin. Microbiol. 2010; 48(6):2009-13. DOI: 10.1128/JCM.02351-09.

13. Tyagi S, Kramer F.R. Molecular beacons: probes that fluoresce upon hybridization. Nat Biotechnol. 1996; 14:303-8. DOI: 10.1038/nbt0396-303.

14. Van Pelt-Verkuil E., van Belkum A., Hays J.P. Principles and technical aspects of PCR amplification. NY: Springer Science; 2008. 332 p. DOI: 10.1007/978-1-4020-6241-4.

15. Kibbe WA. OligoCalc: an online oligonucleotide proper¬ties calculator. Nucleic Acids Res. 2007; 35(Suppl. 2):W43-46. DOI: 10.1093/nar/gkm234.

16. Dedkov V.G., Magassouba N.F., Safonova M.V., et al. 2016. Development and evaluation of a real-time RT-PCR assay for the detection of Ebola virus (Zaire) during an Ebola outbreak in Guinea in 2014-2015. J. Virol. Methods. 2016; 228:26-30. DOI:10.1016/j.jviromet.2015.11.007.

17. Maniatis T., Fritsch E.F., Sambrook J. Molecular cloning, a laboratory manual. Cold Spring Harbor laboratory. 2-ed. Cold Spring Harbor Lab. Press; 1989. 1885p.

18. Cheng Y, Niu J., Zhang Y, Huang J., Li Q. Preparation of his-tagged armored RNA phage particles as a control for real-time reverse transcription-PCR detection of severe acute respiratory syndrome coronavirus. J. Clin. Microbiol. 2006; 44(10):3557-61. DOI: 10.1128/JCM.00713-06.

19. Pasloske B.L., Walkerpeach C.R., Obermoeller R.D., Winkler M., Du Bois D.B. Armored RNA technology for production of ribonuclease-resistant viral RNA controls and standards. J. Clin. Microbiol. 1998; 36(12):3590-4. PMID: 9817878.

20. Chemillod P., Schibler M., Vieille G., Cordey S., Mamin A., Vetter P., Kaiser L. Ebola virus disease diagnosis by real-time RT- PCR: a comparative study of 11different procedures. J. Clin. Virol. 2016; (77):9-14. DOI: 10.1016/j.jcv.2016.01.017.

21. Newcombe R.G. Two-Sided Confidence Intervals for the Single Proportion: Comparison of Seven Methods. Statistics in Medicine. 1998; 17:857-72.

22. Wilson E.B. Probable Inference, the Law of Succession, and Statistical Inference. Journal of the American Statistical Association. 1927; 22:209-12. DOI: 10.1080/01621459.1927.10502953.

23. Bausch D.G., Rollin P.E., Demby A.H., Coulibaly M., Kanu J., Conteh A.S., Wagoner K.D., McMullan L.K., Bowen M.D., Peters C.J., Ksiazek T.G. Diagnosis and clinical virology of Lassa fever as evaluated by enzyme-linked immunosorbent assay, indirect fluorescent-antibody test, and virus isolation. J. Clin. Microbiol. 2000; 38(7):2670-77.

24. Niklasson B.S., Jahrling P.B., Peters C.J. Detection of Lassa virus antigens and Lassavirus-specific immunoglobulins G and M by enzyme-linked immunosorbent assay. J. Clin. Microbiol. 1984; 20(2):239-44. PMID: 6386846.

25. Jahrling P.B., Niklasson B.S., McCormick J.B. Early diag-nosis of human Lassa fever by ELISA detection of antigen and anti-body. Lancet. 1985; 1(8423):250-2. PMID: 2857321.

26. Gunther S., Lenz O. Lassa Virus. Crit. Rev. Clin. Lab. Sci. 2004; 41(4):339-90. DOI: 10.1080/10408360490497456.

27. Drosten C., GottigS., Schilling S., Asper M., Panning M., Schmitz H., Gunther S. Rapid detection and quantification of RNA of Ebola and Marburg viruses, Lassa virus, Crimean-Congo hemorrhagic fever virus, Rift valley fever virus, dengue virus, and yellow fever virus by real-time reverse transcription-PCR. J. Clin. Microbiol. 2002; 40:2323-30. DOI: 10.1128/JCM;40.7.2323-2330.2002.

28. Trappier S.G., Conaty A.L., Farrar B.B., Auperin D.D., McCormick JB., Fisher-Hoch S.P. Evaluation of the polymerase chain reaction for diagnosis of Lassa virus infection. Am. J. Trop. Med. Hyg. 1993; 49(2):214-21. PMID: 8357084.

29. Demby A.Hi, Chamberlain J., Brown D.W., Clegg C.S. Early diagnosis of Lassa fever by reverse transcription-PCR. J. Clin. Microbiol. 1994; 32:2898-903. PMID: 7883875.

30. Trombley A.R., Wachter L., Garrison J., Buckley-Beason V.A., Jahrling J., Hensley L.E., Schoepp R.J., Norwood D.A., Goba A., Fair J.N., Kulesh D.A. Comprehensive Panel of Real-Time TaqMan™ Polymerase Chain Reaction Assays for Detection and Absolute Quantification of Filoviruses, Arenaviruses, and New World Hantaviruses. Am. J. Trop. Med. Hyg. 2010; 82(5):954-60. DOI: 10.4269/ajtmh.2010.09-0636.

31. Bowen M.D., Rollin P.E., Ksiazek T.G., Hustad H.L., Bausch D.G., Demby A.H., Bajani M.D., Peters C.J., Nichol S.T. Genetic Diversity among Lassa Virus Strains. J. Virol. 2000; 74(15):6992-7004. PMID: 10888638.

32. Poch O., Blumberg B.M., Bougueleret L., Tordo N. Sequence comparison of five polymerases (L proteins) of unsegmented negative-strand RNA viruses: Theoretical assignment of functional domains. J. Gen. Virol. 1990; 71:1153-62. DOI: 10.1099/0022-1317-71-5-1153.

33. Poch O., Sauvaget I., Delarue M., Tordo N. Identification of four conserved motifs among the RNA-dependent polymerase encoding elements. EMBO J. 1989; 8:3867-74.