Рекомбинантные ретровирусные частицы: технология получения и использование в качестве положительных контрольных образцов для ПЦР-диагностики опасных вирусных инфекций

Цель работы – разработка технологии получения положительных контрольных образцов на основе рекомбинантных ретровирусных частиц, а также ее применение при создании наборов реагентов для выявления РНК возбудителей опасных и особо опасных вирусных инфекций методом полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией.

Материалы и методы. Для выполнения исследований использованы молекулярнобиологические, генно-инженерные и иммунологические методы: полимеразная цепная реакция, рестрикция, лигирование, клонирование, трансформация, трансфекция и цитофлуориметрия.

Результаты и обсуждение. Разработана и апробирована технология получения положительных контрольных образцов на основе рекомбинантных вирионов, включающая в себя создание генноинженерной конструкции на базе ретровирусного вектора с клонированной в него диагностической последовательностью вирусного генома; получение «пакующей» клеточной линии, продуцирующей химерные ретровирусные частицы; определение титра рекомбинантных вирионов методом проточной цитометрии и полимеразной цепной реакции; использование полученного на их основе препарата в качестве положительного контрольного образца при ПЦР-диагностике инфекционного агента. Технология использования ретровирусных векторов как носителей фрагментов РНК-геномных вирусов применена при разработке тест-систем для ПЦР-диагностики опасных и особо опасных вирусных инфекций, что позволило повысить эксплуатационные качества диагностических наборов и исключить на этапе их производства работу с концентрированными инфекционными агентами, относящимися к 3 и 4 группам риска по классификации ВОЗ (вирусы Ласса, клещевого энцефалита, лимфоцитарного хориоменингита и возбудители геморрагической лихорадки с почечным синдромом).

1. . Сизикова Т.Е., Мельникова Е.В., Маношкин А.В., Петров А.А., Мельников Д.Г., Пантюхин В.Б., Лебедев В.Н., Борисевич С.В. Использование внешних и внутренних контрольных образцов при постановке полимеразной цепной реакции и обратной транскрипции полимеразной цепной реакции. Клиническая лабораторная диагностика. 2013; 3:41–4.

2. . Петров А.А., Лебедев В.Н., Казанцев А.В., Ковальчук Е.А., Сизикова Т.Е., Пышная Н.С., Павельев Д.И., Кутаев Д.А., Борисевич С.В. Использование генно-инженерных конструкций в качестве контрольных образцов при оценке наборов реагентов для выявления РНК возбудителей опасных и особо опасных вирусных инфекций методом обратной транскрипцииполимеразной цепной реакции. Клиническая лабораторная диагностика. 2018; 63(6):372–5. DOI: 10.18821/0869-2084-2018-636-372-375

3. Mikel P., Vasickova P., Kralik P. Methods for preparation of MS2 phage-like particles and their utilization as process control viruses in RT-PCR and qRT-PCR detection of RNA viruses from food matrices and clinical specimens. Food Environ. Virol. 2015; 7(2):96–111. DOI: 10.1007/s12560-015-9188-2.

4. Ninove L., Nougairede A., Gazin C., Thirion L., Delogu I., Zandotti C., Charrel R.N., De Lamballerie X. RNA and DNA bacteriophages as molecular diagnosis controls in clinical virology: a comprehensive study of more than 45,000 routine PCR tests. PLoS One. 2011; 6(2):e16142. DOI: 10.1371/journal.pone.0016142.

5. Wen A., Steinmetz N. Design of virus-based nanomaterials for medicine, biotechnology, and energy. Chem. Soc. Rev. 2016; 45(15):4074–126. DOI: 10.1039/c5cs00287g.

6. Fu Y., Wang G., Wu Q., Yang X., Zhang R., Zhang K., Lin G., Han Y., Bao L., Li Z., Li J. Preparation of MS2-based nanoparticles as control and standard materials for the molecular detection of Dengue virus serotypes. Virus Res. 2017; 233:42–50. DOI: 10.1016/j. virusres.2017.02.011.

7. Mattiuzzo G., Ashall J., Doris K.S., MacLellan-Gibson K., Nicolson C., Wilkinson D.E., Harvey R., Almond N., Anderson R., Efstathiou S., Minor P.D., Page M. Development of lentivirusbased reference materials for Ebola virus nucleic acid amplification technology-based assays. PLoS One. 2015; 10(11):e0142751. DOI: 10.1371/journal.pone.0142751.

8. Dedkov V., Magassouba N., Safonova M., Naydenova E., Ayginin A., Soropogui B., Kourouma F., Camara A., Camara J., Kritzkiy A., Tuchkov I., Shchelkanov M., Maleev V. Development and evaluation of a one-step quantitative RT-PCR assay for detection of Lassa virus. J. Virol. Methods. 2019; 271:113674. DOI: 10.1016/j. jviromet.2019.113674.

9. Gholami M., Ravanshad M., Baesi K., Samiee S., Rozbahani N., Mohraz M. Preparation and evaluation of ribonuclease-resistant viral HIV RNA standards based on armored RNA technology. Iran Biomed J. 2018; 22(6):394–400. DOI: 10.29252/.22.6.394.

10. . Землянский В.А., Дедюля К.Л., Поклонская Н.В., Амвросьева Т.В. Векторная конструкция для накопления армированной РНК. Известия Национальной академии наук Беларуси. Серия медицинских наук. 2015; 2:19–22.

11. Mikel P., Vasickova P., Tesarik R., Malenovska H., Kulich P., Vesely T., Kralik P. Preparation of MS2 phage-like particles and their use as potential process control viruses for detection and quantification of enteric RNA viruses in different matrices. Front. Microbiol. 2016; 7:1911. DOI: 10.3389/fmicb.2016.01911.

12. Borghetti I., Zambenedetti M., Requiгo L., Vieira D., Krieger M., Pontello Rampazzo R. External control viral-like particle construction for detection of emergent arboviruses by real-time reverse-transcription PCR. BioMed Res. Int. 2019; 2019:2560401. DOI: 10.1155/2019/2560401.

13. Куликов С.М., Судариков А.Б., Глинщикова О.А. Внутренний стандарт на основе ретровирусного вектора для определения вируса гепатита С в конкурентной полимеразной цепной реакции. Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. 2004; 6:84–8.

14. Wang X., Liu F., Jiang L., Bao Y., Xiao Y., Wang H. Use of chimeric influenza viruses as a novel internal control for diagnostic rRT-PCR assays. Appl. Microbiol. Biotechnol. 2016; 100(4):1667– 76. DOI: 10.1007/s00253-015-7042-y.

15. Zhou D., Li Y., Li J., Yu J., Yang H., Wei H. Construction of lentivirus-based reference material for RT-PCR detection of Middle East Respiratory Syndrome coronavirus and its application in external quality assessment. J. Nanosci. Nanotechnol. 2019; 19(9):5510– 16. DOI: 10.1166/jnn.2019.16591.

16. Sambrook J., Russell D.W., editors. Molecular Cloning: a Laboratory Manual: in 3 vol. 3rd ed. New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press; 2001. Vol. 1. 749 p.

17. Markowitz D., Goff S., Bank A. Construction and use of a safe and efficient amphotropic packaging cell line. Virology. 1988; 167(2):400–6. PMID: 2462307.

18. Markowitz D., Goff S., Bank A. A safe packaging line for gene transfer: separating viral genes on two different plasmids. J. Virol. 1988; 62(4):1120–4. PMID: 2831375 PMCID: PMC253118.