Мультилокусное сиквенс-типирование штаммов сибиреязвенного микроба, выделенных на территории России и сопредельных государств

Цель – генотипирование методом мультилокусного сиквенс-типирования (MLST) и проведение филогенетического анализа выборки из 40 штаммов Bacillus anthracis, выделенных на территории России и сопредельных государств.

Материалы и методы. В работе осуществлена сборка последовательностей семи генов домашнего хозяйства штаммов B. anthracis на основе данных полногеномного секвенирования нового поколения, после чего описаны выявленные мутации и их координаты. Полученные последовательности использованы для генотипирования исследуемой выборки методом MLST. Результаты сравнены с данными, представленными в базе данных PubMLST. Филогенетический анализ проведен для слитых in silico последовательностей семи локусов выявленных сиквенс-типов. Для построения дендрограмм использован программный пакет MEGA 7.0.

Результаты и обсуждение. В исследованной выборке обнаружено два сиквенс-типа (ST): 35 штаммов относились к ST-1, а пять штаммов, отличающихся одной общей мутацией в локусе glpF, – к ST-3 (согласно кодировке PubMLST), что подчеркивает генетическую обособленность данной группы штаммов. У одного штамма обнаружена уникальная мутация в гене gmk, находящаяся за пределами участка локуса, используемого для MLST. 

1. Carroll L.M., Kovac J., Miller R.A., Wiedmann M. Rapid, high-throughput identification of anthrax-causing and emetic Bacillus cereus group genome assemblies via BTyper, a computational tool for virulence-based classification of Bacillus cereus group isolates by using nucleotide sequencing data. Appl. Environ. Microbiol. 2017; 83(17):e01096-17. DOI: 10.1128/AEM.01096-17.

2. Маринин Л.И., Дятлов И.А., Шишкова Н.А., Герасимов В.Н. Сибиреязвенные скотомогильники: проблемы и решения. М.: Династия; 2017. 215 с.

3. Hoffmann C., Zimmermann F., Biek R., Kuehl H., Nowak K., Mundry R., Agbor A., Angedakin S., Arandjelovic M., Blankenburg A., Brazolla G., Corogenes K., Couacy-Hymann E., Deschner T., Dieguez P., Dierks K., Düx A., Dupke S., Eshuis H., Formenty P., Yuh Y.G., Goedmakers A., Gogarten J.F., Granjon A.C., McGraw S., Grunow R., Hart J., Jones S., Junker J., Kiang J., Langergraber K., Lapuente J., Lee K., Leendertz S.A., Léguillon F., Leinert V., Löhrich T., Marrocoli S., Mätz-Rensing K., Meier A., Merkel K., Metzger S., Murai M., Niedorf S., De Nys H., Sachse A., van Schijndel J., Thiesen U., Ton E., Wu D., Wieler L.H., Boesch C., Klee S.R., Wittig R.M., Calvignac-Spencer S., Leendertz F.H. Persistent anthrax as a major driver of wildlife mortality in a tropical rainforest. Nature. 2017; 548(7665):82–6. DOI: 10.1038/nature23309.

4. Helgason E., Tourasse N.J., Meisal R., Caugant D.A., Kolsto A.B. Multilocus sequence typing scheme for bacteria of the Bacillus cereus group. Appl. Environ. Microbiol. 2004; 70(1):191–201. DOI: 10.1128/aem.70.1.191-201.2004.

5. Agren J., Hamidjaja R.A., Hansen T., Ruuls R., Thierry S., Vigre H., Janse I., Sundstrom A., Segerman B., Koene M., Löfström C., Van Rotterdam B., Derzelle S. In silico and in vitro evaluation of PCR-based assays for the detection of Bacillus anthracis chromosomal signature sequences. Virulence. 2013; 4(8):671–85. DOI: 10.4161/viru.26288.

6. Maiden M.C., Bygraves J.A., Feil E., Morelli G., Russell J.E., Urwin R., Zhang Q., Zhou J., Zurth K., Caugant D.A., Feavers I.M., Achtman M., Spratt B.G. Multilocus sequence typing: a portable approach to the identification of clones within populations of pathogenic microorganisms. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1998; 95(6):3140–5. DOI: 10.1073/pnas.95.6.3140.

7. Enright M.C., Spratt B.G., Kalia A., Cross J.H., Bessen D.E. Multilocus sequence typing of Streptococcus pyogenes and the relationships between emm type and clone. Infect. Immun. 2001; 69(4):2416–27. DOI: 10.1128/iai.69.4.2416-2427.2001.

8. Van Loo I.H.M., Heuvelman K.J., King A.J., Mooi F.R. Multilocus sequence typing of Bordetella pertussis based on surface protein genes. J. Clin. Microbiol. 2002; 40(6):1994–2001. DOI: 10.1128/jcm.40.6.1994-2001.2002.

9. Noller A.C., McEllistrem M.C., Stine O.C., Morris J.G.Jr., Boxrud D.J., Dixon B., Harrison L.H. Multilocus sequence typing reveals a lack of diversity among Escherichia coli O157:H7 isolates that are distinct by pulsed-field gel electrophoresis. J. Clin. Microbiol. 2003; 41(2):675–9. DOI: 10.1128/jcm.41.2.675-679.2003.

10. Kotetishvili M., Stine O.C., Kreger A., Morris J.G., Sulakvelidze A. Multilocus sequence typing for characterization of clinical and environmental Salmonella strains. J. Clin. Microbiol. 2002; 40(5):1626–35. DOI: 10.1128/jcm.40.5.1626-1635.2002.

11. Priest F.G., Barker M., Baillie L.W.J., Holmes E.C., Maiden M.C.J. Population structure and evolution of the Bacillus cereus group. J. Bacteriol. 2004; 186(23):7959–70. DOI: 10.1128/jb.186.23.7959-7970.2004.

12. Sorokin A., Candelon B., Guilloux K., Galleron N., Wackerow-Kouzova N., Ehrlich S.D., Bourguet D., Sanchis V. Multiple-locus sequence typing analysis of Bacillus cereus and Bacillus thuringiensis reveals separate clustering and a distinct population structure of psychrotrophic strains. Appl. Environ. Microbiol. 2006; 72(2):1569–78. DOI: 10.1128/aem.72.2.1569-1578.2006.

13. Tourasse N.J., Helgason E., Okstad O.A., Hegna I.K., Kolsto A.B. The Bacillus cereus group: novel aspects of population structure and genome dynamics. J. Appl. Microbiol. 2006; 101(3):579–93. DOI: 10.1111/j.1365-2672.2006.03087.x.

14. PubMLST – Public databases for molecular typing and microbial genome diversity. [Электронный ресурс]. URL: https://pubmlst.org/bcereus/(дата обращения 20.11.2020).

15. Ogawa H., Fujikura D., Ohnuma M., Ohnishi N., Hang'ombe B.M., Mimuro H., Ezaki T., Mweene A.S., Higashi H. A novel multiplex PCR discriminates Bacillus anthracis and its genetically related strains from other Bacillus cereus group species. PLoS One. 2015; 10(3):e0122004. DOI: 10.1371/journal.pone.0122004.

16. Venkateswaran K, Singh N.K, Checinska Sielaff A., Pope R.K., Bergman N.H., van Tongeren S.P., Patel N.B., Lawson P.A., Satomi M., Williamson C., Sahl J.W., Keim P., Pierson D., Perry J. Non-toxin-producing Bacillus cereus strains belonging to the B. anthracis clade isolated from the international space station. mSystems. 2017; 2(3):e00021-17. DOI: 10.1128/mSystems.00021-17.

17. Hunter P.R., Gaston M.A. Numerical index of the discriminatory ability of typing systems: an application of Simpson’s index of diversity. J. Clin. Microbiol. 1988; 26(11):2465–6. DOI: 10.1128/JCM.26.11.2465-2466.1988.

18. Sue D., Marston C.K., Hoffmaster A.R., Wilkins P.P. Genetic diversity in a Bacillus anthracis historical collection (1954 to 1988). J. Clin. Microbiol. 2007; 45(6):1777–82. DOI:10.1128/JCM.02488-06.

19. Timofeev V., Bahtejeva I., Mironova R., Titareva G., Lev I., Christiany D., Borzilov A., Bogun A., Vergnaud G. Insights from Bacillus anthracis strains isolated from permafrost in the tundra zone of Russia. PLoS One. 2019; 4(5):e0209140. DOI: 10.1371/journal. pone.0209140.

20. Гончарова Ю.О., Бахтеева И.В., Титарева Г.М., Миронова Р.И., Кисличкина А.А., Майская Н.В., Мокриевич А.Н., Тимофеев В.С. Аллельный полиморфизм гена lef у штаммов возбудителя сибирской язвы из Государственной коллекции патогенных микроорганизмов («ГКПМ-Оболенск»). Бактериология. 2019; 4(2):7–12. DOI: 10.20953/2500-1027-2019-2-7-12.

21. BLAST. [Электронный ресурс]. URL: https://blast.ncbi. nlm.nih.gov/Blast.cgi (дата обращения 01.11.2020).

22. Pisarenko S.V., Eremenko E.I., Ryazanova A.G., Kovalev D.A., Buravtseva N.P., Aksenova L.Y., Evchenko A.Y., Semenova O.V., Bobrisheva O.V., Kuznetsova I.V., Golovinskaya T.M., Tchmerenko D.K., Kulichenko A.N., Morozov V.Y. Genotyping and phylogenetic location of one clinical isolate of Bacillus anthracis isolated from a human in Russia. BMC Microbiol. 2019; 19(1):165. DOI: 10.1186/s12866-019-1542-3.

23. Braun P., Grass G., Aceti A., Serrecchia L., Affuso A., Marino L., Grimaldi S., Pagano S., Hanczaruk M., Georgi E., Northoff B., Schöler A., Schloter M., Antwerpen M., Fasanella A. Microevolution of anthrax from a young ancestor (M.A.Y.A.) suggests a soil-borne life cycle of Bacillus anthracis. PLoS One. 2015; 10(8):e0135346. DOI: 10.1371/journal.pone.0135346.

24. Vergnaud G. Bacillus anthracis evolution: taking advantage of the topology of the phylogenetic tree and human history to propose dating points. Erciyes Med. J. 2020; 42(4):362–9. DOI: 10.14744/etd.2020.64920.

25. Keim P., Van Ert M.N., Pearson T., Vogler A.J., Huynh L.Y., Wagner D.M. Anthrax molecular epidemiology and forensics: using the appropriate marker for different evolutionary scales. Infect. Genet. Evol. 2004; 4(3):205–13. DOI: 10.1016/j.meegid.2004.02.005.