Preview

Проблемы особо опасных инфекций

Расширенный поиск

Применение зимографического и протеомного анализа для идентификации внутриклеточных и экстрацеллюлярных протеаз производственных штаммов Vibrio cholerae

https://doi.org/10.21055/0370-1069-2021-1-128-133

Полный текст:

Аннотация

Целью работы является применение зимографического и протеомного анализа для изучения состава и функций внутриклеточных и экстрацеллюлярных протеаз производственных штаммов Vibrio cholerae 569В серовара Инаба и М41 серовара Огава.

Материалы и методы. Образцы внутриклеточных протеаз получали из клеточных лизатов путем обработки бактериальных клеток ультразвуком в 9 М растворе мочевины. Фракцию экстрацеллюлярных протеаз осаждали из культуральной жидкости добавлением 50 % трихлоруксусной кислоты до конечной концентрации 10 % и инкубацией на льду. В качестве контроля протеолитической активности использовали лиофилизированные препараты протеиназы К и ферментного комплекса протеовибрина. Протеазы выявляли методом субстратного гель-электрофореза в 12,5 % полиакриламидном геле, импрегнированном 0,1 % желатином с последующей идентификацией состава белковых фракций лизатов и экзопротеинов обоих штаммов с помощью молекулярного масс-спектрометрического сканирования.

Результаты и обсуждение. Сравнительное исследование производственных штаммов V. cholerae 569В серовара Инаба и М41 серовара Огава с помощью зимографического и протеомного анализа показало, что наибольшая ферментативная активность выявлена в образце фракции экстрацеллюлярных протеаз штамма V. cholerae М41, где идентифицировано пять основных и четыре минорных зоны гидролиза желатина, причем зоны высокой интенсивности с МW 20–23 и 37‒40 кДа обнаружены также в препарате протеовибрина, выделенного из культуральной жидкости этого штамма. В результате протеомного анализа исследуемых штаммов достоверно идентифицированы 66 ферментов V. cholerae с различной функциональной активностью, среди которых 15 ферментов обладали протеазной активностью. Высокая информативность комплекса современных методов показала возможность выявления качественных и количественных различий состава внутриклеточных и экстрацеллюлярных протеаз производственных штаммов V. cholerae, что предлагает эффективное средство скрининга межштаммовых различий протеазного спектра у производственных штаммов.

Об авторах

Т. А. Полунина
ФКУЗ «Российский научно-исследовательский противочумный институт «Микроб»
Россия

410005, Саратов, ул. Университетская, 46



Н. В. Котова
ФКУЗ «Российский научно-исследовательский противочумный институт «Микроб»
Россия

410005, Саратов, ул. Университетская, 46



Д. В. Баданин
ФКУЗ «Российский научно-исследовательский противочумный институт «Микроб»
Россия

410005, Саратов, ул. Университетская, 46



А. В. Федоров
ФКУЗ «Российский научно-исследовательский противочумный институт «Микроб»
Россия

410005, Саратов, ул. Университетская, 46



О. В. Громова
ФКУЗ «Российский научно-исследовательский противочумный институт «Микроб»
Россия

410005, Саратов, ул. Университетская, 46



Я. М. Краснов
ФКУЗ «Российский научно-исследовательский противочумный институт «Микроб»
Россия

410005, Саратов, ул. Университетская, 46



Н. А. Осина
ФКУЗ «Российский научно-исследовательский противочумный институт «Микроб»
Россия

410005, Саратов, ул. Университетская, 46



Список литературы

1. Козлов С.Н., Николаев В.Б., Марков Е.Ю., Миронова Л.В., Урбанович Л.Я. Протеолитическое расщепление иммуноглобулинов G субклеточными фракциями Vibrio cholerae O1 и О139 серогрупп. Acta Biomedica Scientifica. 2013; 6:145–8.

2. Shinoda S. Proteases produced by Vibrio cholerae and other pathogenic vibrios: pathogenic roles and expression. In: Ramamurthy T., Bhattacharya S.K., editors. Epidemiological and Molecular Aspects on Choleraе. New York: Springer; 2011. P. 245–58. DOI: 10.1007/978-1-60327-265-0_14.

3. Stewart-Tull D.E., Bleakley C.R., Galloway T.S. Charac­ teristics of Vibrio cholerae proteinases: potential, candidate vaccine antigens. Vaccine. 2004; 22(23–24):3026–34. DOI: 10.1016/j. vaccine.2004.02.012.

4. Балабан Н.П. Металлопротеазы бацилл. Классификация, структурные особенности и термостабильность белков. Ученые записки Казанского государственного университета. Серия: Естественные науки. 2007; 149(2):6–23.

5. Балабан Н.П., Рудакова Н.Л., Сабирова А.Р., Ильинская О.Н., Шарипова М.Р. Металлоэндопептидазы клана метцинкинов: классификация, свойства, структурные особенности. Ученые записки Казанского государственного университета. Серия: Естественные науки. 2010; 152(2):57–77.

6. Lutfullah. G., Azhar N., Amin F., Khan Z., Azim M.K., Shouqat K., Noor S., Ali R. Structural bioinformatics of Vibrio chole­ rae aminopeptidase A (PepA) monomer. Protein Pept. Lett. 2009; 16:36–45. DOI: 10.2174/092986609787049484.

7. Vaitkevicius K., Rompikuntal P.K., Lindmark B., Vaitkevicius R., Song T., Wai S. The metalloprotease PrtV from Vibrio choleraе – purification and properties. FEBS J. 2008; 275(12):3167–77. DOI: 10.1111/j.1742-4658.2008.06470.x.

8. Козлов С.Н. Протеолитические ферменты Vibrio cholerae и близкородственных бактерий рода Vibrio. Иркутск; 2011. 27 с.

9. Syngkon A., Elluri S., Koley H., Rompikuntal P., Saha D., Chakrabarti M. Studies on a novel serine protease of a ΔhapAΔprtV Vibrio cholerae O1 strain and its role in hemorrhagic response in the rabbit ileal loop model. PLoS One. 2010; 5(9):e13122. DOI: 10.1371/journal.pone.0013122.

10. Козлов С.Н., Николаев В.Б., Марков Е.Ю., Урбанович Л.Я., Миронова Л.В. Мембраносвязанные протеазы омрТ+ и омрТштаммов холерного вибриона. Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. 2013; 2:3–12.

11. Козлов С.Н., Николаев В.Б., Марков Е.Ю., Урбанович Л.Я. Зимографический анализ водорастворимых протеаз Vibrio cholerae O1 и О139 серогрупп. Acta Biomedica Scientifica. 2013; 2(2):139–43.

12. Кузьмиченко И.А., Громова О.В., Джапаридзе М.Н., Киреев М.Н., Белякова Н.И., Клокова О.Д. Тест-среды для определения активности твиназы, протеазы и фосфолипазы в холерной химической вакцине и ее компонентах. Проблемы особо опасных инфекций. 2002; 1(83):148–53.

13. Громова О.В., Кузьмиченко И.А., Нижегородцев С.А., Киреев М.Н., Корсуков В.Н. Новый способ получения комплекса ферментов холерного вибриона-протеовибрина с помощью ультрафильтрации. Бюллетень ВСНЦ СО РАМН. 2012; 5(87):201–5.

14. Lantz M.S., Ciborowski P. Zymographic techniques for detection and characterization of microbial proteases. Methods Enzymol. 1994; 235:563–94. DOI: 10.1016/0076-6879(94)35171-6.

15. Shevchenko A., Tomas H., Havlis J., Olsen J.V., Mann M. In-gel digestion for mass spectrometric characterization of proteins and proteome. Nature protocols. 2006; 1(6):2856–60. DOI: 10.1038/nprot.2006.468.

16. Yu A.C.Y., Worrall L.J., Strynadka N.C.J. Structural insight into the bacterial mucinase StcE essential to adhesion and immune evasion during enterohemorrhagic E. coli infection. Structure. 2012; 20(4):707–17. DOI: 10.1016/j.str.2012.02.015.

17. Rawlings N.D., Barrett A.J. Evolutionary families of metallopeptidases. Methods Enzymol. 1995; 248:183–228. DOI: 10.1016/0076-6879(95)48015-3.

18. Conlin C.A, Miller C.G. Dipeptidyl carboxypeptidase and oligopeptidase A from Escherichia coli and Salmonella typhimurium. Methods Enzymol. 1995; 248:567–79. DOI: 10.1016/0076-6879(95)48036-6.

19. Kolmar H., Waller P.R., Sauer R.T. The DegP and DegQ periplasmic endoproteases of Escherichia coli: specificity for cleavage sites and substrate conformation. J. Bacteriol. 1996; 178(20):5925–9. DOI: 10.1128/jb.178.20.5925-5929.1996.

20. Chung C.H., Goldberg A.L. Lon-A Peptidase, Endopeptidase La. Handbook of Proteolytic Enzymes. 2013; 3:3527–33. DOI: 10.1016/B978-0-12-382219-2.00781-X.


Для цитирования:


Полунина Т.А., Котова Н.В., Баданин Д.В., Федоров А.В., Громова О.В., Краснов Я.М., Осина Н.А. Применение зимографического и протеомного анализа для идентификации внутриклеточных и экстрацеллюлярных протеаз производственных штаммов Vibrio cholerae. Проблемы особо опасных инфекций. 2021;(1):128-133. https://doi.org/10.21055/0370-1069-2021-1-128-133

For citation:


Polunina T.A., Kotova N.V., Badanin D.V., Fedorov A.V., Gromova O.V., Krasnov Ya.M., Osina N.A. Application of Zymographic and Proteomic Analysis for Identification of Intracellular and Extracellular Proteases of Vibrio cholerae Production Strains. Problems of Particularly Dangerous Infections. 2021;(1):128-133. (In Russ.) https://doi.org/10.21055/0370-1069-2021-1-128-133

Просмотров: 56


Creative Commons License
Контент доступен под лицензией Creative Commons Attribution 4.0 License.


ISSN 0370-1069 (Print)
ISSN 2658-719X (Online)