Получение и характеристика гибридом-продуцентов моноклональных антител к шигаподобным токсинам I и II типов

Цель – получить и охарактеризовать гибридомы-продуценты моноклональных антител к шигаподобным токсинам I и II типов.

Материалы и методы. В работе использованы препараты шигаподобных токсинов I и II типов, полученные в филиале ФГБУ «48 ЦНИИ» Минобороны России (г. Киров); мыши линии BALB/c; клетки миеломы SP2/0-Ag14. Гибридизацию спленоцитов иммунных мышей и миеломных клеток проводили по методике G. Kohler и C. Milstein в модификации De St. Fazekas и D. Scheidegger с использованием 50 % полиэтиленгликоля. Гибридные клеточные линии, продуцирующие специфические моноклональные антитела, клонировали методом лимитирующих разведений. Изучение ростовых и секреторных свойств гибридом проводили при культивировании in vitro и in vivo. Специфическую активность иммунных сывороток, культуральных и асцитических жидкостей гибридом исследовали методом непрямого иммуноферментного анализа. Моноклональные антитела из асцитических жидкостей выделяли осаждением сульфатом аммония с последующей очисткой ионообменной хроматографией.

Результаты и обсуждение. Получена панель из 8 гибридом-продуцентов моноклональных антител к шигаподобным токсинам I и II типов. Гибридомы характеризуются стабильностью пролиферативной и антителопродуцирующей активности на протяжении десяти пассажей in vitro и трех пассажей in vivo (срок наблюдения). Полученные моноклональные антитела могут быть использованы для детекции иммуноферментным методом шигаподобных токсинов I и II типов. При этом минимальная выявляемая концентрация искомых аналитов в сэндвич-варианте иммуноферментного анализа составила 1 нг/мл. Показана возможность выявления шигаподобных токсинов без типовой дифференциации при использовании в иммуноферментном анализе полирецепторной смеси моноклональных антител для сенсибилизации планшета и полиспецифичной смеси иммунопероксидазных конъюгатов.

1. Мelton-Celsa A.R. Shiga toxin (Stx) classifcation, structure, and function. Microbiol. Spectr. 2014; 2(4):EHEC-0024-2013. DOI: 10.1128/microbiolspec.EHEC-0024-2013.

2. Szewczak A.A., Moore P.B., Chang Y.L., Wool I.G. The conformation of the sarcin/ricin loop from 28S ribosomal RNA. Proc. Natl Acad. Sci. USA. 1993; 90(20):9581–5. DOI: 0.1073/pnas.90.20.9581.

3. Gyles C.L. Shiga toxin-producing Escherichia coli: an overview. J. Anim. Sci. 2007; 85(13):E45–E62. DOI: 10.2527/jas.2006-508.

4. Paletta A.C.C., Castro V.S., Conte-Junior C.A. Shiga toxinproducing and enteroaggregative Echerichia coli in animal, foods and humans: pathogenicity mechanisms, detection methods, and epidemiology. Curr. Microbiol. 2020; 77(4):612–20. DOI: 10.1007/s00284-019-01842-1.

5. Taylor С.М. Enterohaemorrhagic Escherichia coli and Shigella dysenteriae type 1-induced haemolytic uraemic syndrome. Pediatr. Nephrol. 2008; 23(9):1425–31. DOI: 10.1007/s00467-008-0820-3.

6. Joseph A., Cointe A., Kurkdjian P.М., Rafat C., Hertig A. Shiga toxin-associated hemolytic uremic syndrome: а narrative review. Toxins (Basel). 2020; 12(2):67. DOI: 10.3390/toxins2020067.

7. E. coli: Rapid Responce in a crisis. European Food Safety Authority. [Электронный ресурс]. URL: www.efsa.europa.eu/en/press/news/120711 (дата обращения 10.07.2020).

8. Онищенко Г.Г., Дятлов И.А., Светоч Э.А., Воложанцев Н.В., Баннов В.А., Карцев Н.Н., Борзенков В.Н., Фурсова Н.К., Шемякин И.Г., Богун А.Г., Кисличкина А.А., Попова А.В., Мякинина В.П., Теймуразов М.Г., Полосенко О.В., Кафтырева Л.А., Макарова М.А., Матвеева З.Н., Гречанинова Т.А., Григорьева Н.С., Кича Е.В., Забалуева Г.В., Кутасова Т.Б., Коржаев Ю.Н., Башкетова Н.С., Бушманова О.Н., Сталевская А.В., Чхинджерия И.Г., Жебрун А.Б. Молекулярно-генетическая характеристика шига-токсинпродуцирующих Escherichia сoli, выделенных при вспышке пищевой инфекции в Санкт-Петербурге в 2013 году. Вестник РАМН. 2015; 1:70–81. DOI: 10.15690/vramn.v70i1.1234.

9. Lowry O.H., Rosebrough N.J., Farr A.L., Randall R.J. Protein measurement with the Folin phenol reagent. J. Biol. Chem. 1951; 193(1):265–75.

10. De StGroth S.F., Scheidegger D. Production of monoclonal antibodies: strategy and tactics. J. Immunol. Methods. 1980; 35(1-2):1–21. DOI: 10.1016/0022-1759(80)90146-5.

11. Kohler G., Milstein C. Continuous culture of fused cells secreting antibody of predefned specifcity. Nature. 1975; 256(5517):495–7. DOI: 10.1038/256495a0.

12. Кэтти Д., редактор. Антитела. Методы: Кн. 2: пер. с англ. М.: Мир; 1991. 384 с.

13. Nakane P.K., Kawaoi A. Peroxidase-labeled antibody. A new method of conjugated. J. Histochem. Cytochem. 1974; 22(12): 1084–91. DOI: 10.1177/22.12.1084.