Разработка способа определения биоваров Brucella suis методом мультилокусной ПЦР с учетом результатов в режиме реального времени

Цель исследования – разработка методического подхода для определения биоваров Brucella suis методом мультилокусной ПЦР с учетом результатов в режиме реального времени. 
Материалы и методы. В работе использовали 16 штаммов B. suis различных биоваров, по 2 шт. – B. neotomae и B. canis. Определение таксономической принадлежности штаммов бруцелл осуществляли по протоколам Bruce-ladder, Suis-ladder, БРУ-ДИФ. Подбор праймеров и зондов проводили с помощью программного обеспечения на сайте www.genscript.com и программы GeneRanner 6.5.52. Фрагментное секвенирование по Сэнгеру осуществляли на генетическом анализаторе 3500 XL в соответствии с рекомендациями производителя. Оценку гомологии нуклеотидных последовательностей проводили по алгоритму BLAST, используя базу данных GenBank NCBI. 
Результаты и обсуждение. У штаммов B. suis различных биоваров проведен анализ структурной организации геномных островов IncP и GI-3. Установлено, что у штаммов 2, 4 биоваров B. suis и B. canis в результате гомологичной рекомбинации в геномном острове IncP утрачена концевая часть гена BRA0368, включающая 21 нуклеотид (повторяющийся в гене BRA0367) и стоп-кодон TAA, а также практически полностью последовательность гена BRA0367. Прямой повтор из 21 нуклеотида и стоп-кодона TGA гена BRA0367 заместил аналогичную область гена BRA0368, что привело к образованию делеции размером 185 п.н. В структуре GI-3 отличий у биоваров отмечено не было. Полученные результаты позволили разработать подход (Suis-ДИФ) для дифференциации биоваров B. suis, основанный на амплификации генов, расположенных в геномных островах IncP и GI-3, методом ПЦР с учетом результатов в режиме реального времени. Подтверждена его специфичность при исследовании штаммов B. suis из фонда Государственной коллекции патогенных бактерий ФКУЗ РосНИПЧИ «Микроб». Проведенные исследования расширяют и дополняют сведения о генетической неоднородности видов и биоваров бруцелл. Предложенный способ определения биоваров B. suis методом мультилокусной ПЦР с учетом результатов в режиме реального времени расширяет возможности идентификации бруцелл с помощью молекулярно-генетических методов.

1. Касьян Ж.А., Осина Н.А., Щербакова С.А. Разработка тест-системы для дифференциации видов бруцелл методом ПЦР с учетом результатов в режиме реального времени. Проблемы особо опасных инфекций. 2016; 3:47–51. DOI: 10.21055/0370-1069-2016-3-47-51.

2. Lopez-Goni I., Garcia-Yoldi D., Marin C.M., de Miguel M.J., Munoz P.M., Blasco J.M., Jacques I., Grayon M., Cloeckaert A., Ferreira A.C., Cardoso R., Correa de Sa M.I., Walravens K., Albert D., Garin-Bastuji B. Evaluation of a multiplex PCR assay (Bruce-ladder) for molecular typing of all Brucella species, including the vaccine strains. J. Clin. Microbiol. 2008; 46(10):3484–7. DOI: 10.1128/JCM.00837-08.

3. Lopez-Goni I., Garcia-Yoldi D., Marin C.M., de Miguel M.J., Barquero-Calvo E., Guzman-Verri C., Albert D., Garin-Bastuji B. New Bruce-ladder multiplex PCR assay for the biovar typing of Brucella suis and the discrimination of Brucella suis and Brucella canis. Vet. Microbiol. 2011; 154(1–2):152–5. DOI: 10.1016/j.vetmic.2011.06.035.

4. Probert W.S., Schrader K.N., Khuong N.Y., Bystrom S.L., Graves M.H. Real-time multiplex PCR assay for detection of Brucella spp., B. abortus, and B. melitensis. J. Clin. Microbiol. 2004; 42(3):1290–3. DOI: 10.1128/JCM.42.3.1290-1293.2004.

5. Redkar R., Rose S., Bricker B., DelVecchio V. Realtime detection of Brucella abortus, Brucella melitensis and Brucella suis. Mol. Cell. Probes. 2001; 15(1):43–52. DOI: 10.1006/mcpr.2000.0338.

6. Осина Н.А., Касьян Ж.А., Касьян И.А., Ляшова О.Ю., Осин А.В. Определение видовой принадлежности штаммов бруцелл из фонда Государственной коллекции патогенных бактерий «Микроб» с помощью амплификационных и рестрикционных технологий. Проблемы особо опасных инфекций. 2016; 4:69–74. DOI: 10.21055/0370-1069-2016-4-69-74.

7. Касьян Ж.А., Осина Н.А., Касьян И.А. Способ определения видовой принадлежности возбудителя бруцеллеза методом ПЦР с гибридизационно-флуоресцентным учетом результатов в режиме реального времени. Патент РФ № RU2621864C1, опубл. 07.06.2017. Бюл. № 16.

8. Mancilla M. The Brucella genomic islands. In Brucella: Molecular Microbiology and Genomics. Lopez-Goni I., O’Callaghan D., editors. Norfolk, UK: Caister Academic Press; 2012. P. 36–57. DOI: 10.21775/9781913652531.

9. Paulsen I.T., Seshadri R., Nelson K.E., Eisen J.A., Heidelberg J.F., Read T.D., Dodson R.J., Umayam L., Brinkac L.M., Beanan M.J., Daugherty S.C., Deboy R.T., Durkin A.S., Kolonay J.F., Madupu R., Nelson W.C., Ayodeji B., Kraul M., Shetty J., Malek J., Van Aken S.E., Riedmuller S., Tettelin H., Gill S.R., White O., Salzberg S.L., Hoover D.L., Lindler L.E., Halling S.M., Boyle S.M., Fraser C.M. The Brucella suis genome reveals fundamental similarities between animal and plant pathogens and symbionts. Proc. Natl Acad. Sci. USA. 2002; 99(20):13148–53. DOI: 10.1073/pnas.192319099.