Детекция Bacillus anthracis по генам профага lambda_Ba03 посредством ПЦР в реальном времени

Цель исследования – разработка набора праймеров и флуоресцентных зондов для детекции двух хромосомных мишеней Bacillus anthracis методом ПЦР в реальном времени на основе генов профага lambda_Ba03.

Материалы и методы. При BLAST-анализе хромосомной ДНК B. anthracis в качестве мишеней определены два гена профага lambdaBa03: BA_5358 (AE016879.1: 4852332..4853642) и BA_5361 (AE016879.1: 4855298..4856278). Разработанные праймеры и флуоресцентные гидролизуемые пробы TaqMan для одновременной детекции хромосомной ДНК B. anthracis по двум указанным генам проверены в реакциях ПЦР в реальном времени на чувствительность и специфичность.

Результаты и обсуждение. Проведенные исследования на образцах хромосомной ДНК близкородственных бактерий (B. cereus, B. thuringiensis, B. subtilis, B. clausii) показали 100 % специфичность разработанных сетов праймеров/зондов. Чувствительность разработанного мультиплексного набора, исследованная на образцах ДНК вакцинного штамма м55‑ВНИИВВиМ и архивных образцах ДНК B. anthracis, составила 100 фг бактериальной ДНК, что в пересчете определяет предел чувствительности в 16,72 бактериального генома на реакцию. Разработанный мультиплексный набор позволяет использовать его как отдельный инструмент для исследовательских лабораторий, изучающих сибирскую язву.

1. Koehler T.M., Dai Z., Kaufman-Yarbray M. Regulation of the Bacillus anthracis protective antigen gene: CO2 and a transacting element activate transcription from one of two promoters. J. Bacteriol. 1994; 3:586–95. DOI: 10.1128/jb.176.3.586-595.1994.

2. Goel A.K. Anthrax: A disease of biowarfare and public health importance. World J. Clin. Cases. 2015; 1:20–33. DOI: 10.12998/wjcc.v3.i1.20.

3. Ezzell J.W., Welkos S.L. The capsule of Bacillus anthracis, a review. J. Appl. Microbiol. 1999; 2:250–67. DOI: 10.1046/j.13652672.1999.00881.x.

4. Helgason E., Okstad O.A., Caugant D.A., Johansen H.A., Fouet A., Mock M., Hegna I., Kolstø A.B. Bacillus anthracis, Bacillus cereus, and Bacillus thuringiensis – one species on the basis of genetic evidence. Appl. Environ. Microbiol. 2000; 6:2627–30. DOI: 10.1128/AEM.66.6.2627-2630.2000.

5. Pannucci J., Okinaka R.T., Sabin R., Kuske C.R. Bacillus anthracis pXO1 plasmid sequence conservation among closely related bacterial species. J. Bacteriol. 2002; 1:134–41. DOI: 10.1128/JB.184.1.134-141.2002.

6. Van der Auwera G.A., Andrup L., Mahillon J. Conjugative plasmid pAW63 brings new insights into the genesis of the Bacillus anthracis virulence plasmid pXO2 and of the Bacillus thuringiensis plasmid pBT9727. BMC Genomics. 2005; 6:103. DOI: 10.1186/14712164-6-103.

7. Ågren J., Hamidjaja R.A., Hansen T., Ruuls R., Thierry S., Vigre H., Janse I., Sundström A., Segerman B., Koene M., Löfström C., Van Rotterdam B., Derzelle S. In silico and in vitro evaluation of PCR based assays for the detection of Bacillus anthracis chromosomal signature sequences. Virulence. 2013; 8:671–85. DOI: 10.4161/viru.26288.

8. Shevtsov A., Lukhnova L., Izbanova U., Vernadet J.-P., Kuibagarov M., Amirgazin A., Ramankulov Y., Vergnaud G. Bacillus anthracis phylogeography: new clues from Kazakhstan, Central Asia. Front. Microbiol. 2021; 12:778225. DOI: 10.3389/fmicb.2021.778225.

9. Nossa C.W., Oberdorf W.E., Yang L., Aas J.A., Paster B.J., Desantis T.Z., Brodie E.L., Malamud D., Poles M.A., Pei Z. Design of 16S rRNA gene primers for 454 pyrosequencing of the human foregut microbiome. World J. Gastroenterol. 2010; 16(33):4135–44. DOI: 10.3748/wjg.v16.i33.4135.

10. McKiernan H.E., Danielson P.B. Molecular Diagnostic Applications in Forensic Science. In: Patrinos G.P., editor. Molecular Diagnostics (3d edition). Academic Press; 2017. Р. 371–94. DOI: 10.1016/B978-0-12-802971-8.00021-3.