Получение и характеристика гибридом-продуцентов моноклональных антител к антигенам коронавируса SARS-CоV-2

Цель работы – получить и охарактеризовать гибридомы-продуценты моноклональных антител к антигенам коронавируса SARS‑CoV‑2, перспективных для конструирования диагностических иммунохимических тестов. Материалы и методы. Для иммунизации мышей линии BALB/c использовали рекомбинантные антигены NP и RBD SARS-CоV-2. Антигенные препараты сорбировали на геле алюминия гидроксида и вводили подкожно мышам линии BALB/c с интервалом 7 дней. Слияние иммунных спленоцитов с клетками миеломной опухоли SP2/0-Ag14 проводили с помощью ПЭГ -1450. Отбор гибридом, секретирующих анти-NP- и анти-RBD-антитела, проводили методом непрямого иммуноферментного анализа (ИФА) в 96-луночных планшетах с сорбированными препаратами NP и RBD. Для клонирования гибридом использовали метод предельных разведений. Изучение секреторных свойств полученных клонов проводили при культивировании in vitro в 24-луночных культуральных планшетах. Иммуноасцитические жидкости получали при культивировании гибридных клеток в брюшной полости мышей линии BALB/c. Моноклональные антитела очищали методом аффинной хроматографии на сорбенте протеин А-сефарозе, конъюгировали с пероксидазой хрена и проверяли возможность использования в сэндвич-варианте ИФА для детекции инактивированного коронавируса SARS-CоV-2 штамма «Изолят В». Результаты и обсуждение. В результате гибридизаций и отбора клонов получены гибридомы-продуценты моноклональных антител к NP и RBD коронавируса SARS-CоV-2. При культивировании in vitro и in vivo клоны характеризовались стабильностью пролиферативной и антителопродуцирующей активности. Использование моноклонального антитела 415D12 в качестве захватывающего и конъюгированного с пероксидазой хрена 411D12 в качестве детекторного моноклонального антитела в ИФА позволяет выявить коронавирус SARS-CоV-2 в минимальной концентрации 1·103 БОЕ /мл.

1. SARS‑CoV‑2-related data provided by the Protein Domains resource [Электронный ресурс]. URL: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/SARS‑CoV‑2.html (дата обращения 15.08.2022).

2. Guo L., Ren L., Yang S., Xiao M., Chang D., Yang F., Dela Cruz C.S., Wang Y., Wu C., Xiao Y., Zhang L., Han L., Dang S., Xu Y., Yang Q.W., Xu S.Y., Zhu H.D., Xu Y.C., Jin Q., Sharma L., Wang L., Wang J. Profiling early humoral response to diagnose novel coronavirus disease (COVID-19). Clin. Infect. Dis. 2020; 71(15):778–5. DOI: 10.1093/cid/ciaa310.

3. Shanmugaraj B., Siriwattananon K., Wangkanont K., Phoolcharoen W. Perspectives on monoclonal antibody therapy as potential therapeutic intervention for Coronavirus disease-19 (COVID-19). Asian Рас. J. Allergy Immunol. 2020; 38(1):10–8. DOI: 10.12932/AP-200220-0773.

4. Wang C., Li W., Drabek D., Okba N.M.A., van Haperen R., Osterhaus A.D.M.E., van Kuppeveld F.J.M., Haagmans B.L., Grosveld F., Bosch B.J. A human monoclonal antibody blocking SARS‑CoV‑2 infection. Nat. Commun. 2020; 11(1):2251. DOI: 10.1038/s41467-020-16256-y.

5. Шевяков А.Г. Получение мышиных моноклональных антител к нуклеокапсиду нового коронавируса SARS‑CoV‑2. Проблемы медицинской микологии. 2021; 23(2):164.

6. Xie С., Ding Н., Ding J., Xue Y., Lu S., Lv H. Preparation of highly specific monoclonal antibodies against SARS‑CoV‑2 nucleocapsid protein and the preliminary development of antigen detection test strips. J. Med. Virol. 2022; 94(4):1633–40. DOI: 10.1002/jmv.27520.

7. Чуркин И.А., Ручко С.В., Суровяткина И.В., Лебедев В.Н., Панкова Е.И., Сыромятникова С.И., Степанов Н.Н., Харченко В.А., Максимов В.А. Штамм гибридных клеток T2/S-6E11 животных Mus musculus L., продуцирующих моноклональные антитела к коронавирусу – возбудителю тяжелого острого респираторного синдрома. Патент РФ № 2291195, опубл. 10.01.2007.

8. Шахпаронов М.И., Павлюков М.С., Антипова Н.В. Моноклональное антитело к RBD фрагменту в составе S белка вируса SARS‑CoV‑2. Патент РФ № 2744274, опубл. 04.03.2021.

9. Есмагамбетов И.Б., Щебляков Д.В., Лебедин Ю.С. Фаворская И.А., Должикова И.В., Деркаев А.А., Рябова Е.И., Прокофьев В.В., Алексеева И.А., Воронина Д.В., Зорков И.Д., Ковыршина А.В., Илюхина А.А., Ботиков А.Г., Карпов А.П., Лубенец Н.Л., Зубкова О.В., Семихин А.С., Народицкий Б.С., Логунов Д.Ю., Гинцбург А.Л. Гуманизированное моноклональное антитело, специфически связывающееся с RBD S белка вируса SARS‑CoV‑2, средство и способ для терапии и экстренной профилактики заболеваний, вызываемых вирусом SARS‑CoV‑2. Патент РФ № 2765731, опубл. 02.02.2022.

10. Köhler G., Milstein C. Continuous culture of fused cells secreting antibody of predefined specificity. Nature. 1975; 256(5517):495–7. DOI: 10.1038/256495a0.

11. de StGroth S.F., Scheidegger D. Production of monoclonal antibodies: strategy and tactics. J. Immunol. Methods. 1980; 35(1‑2):1–21. DOI: 10.1016/0022-1759(80)90146-5.

12. Nakane P.K., Kawaoi A. Peroxidase-labeled antibody. A new method of conjugated. J. Histochem. Cytochem. 1974; 22(12):1084–91. DOI: 10.1177/22.12.1084.

13. Lu R.-M., Ko S.-H., Chen W.-Y., Chang Y.-L., Lin H.-T., Wu H.-C. Monoclonal antibodies against nucleocapsid protein of SARS‑CoV‑2 variant for detection of COVID-19. Int. J. Mol. Sci. 2021; 22(22):12412. DOI: 10.3390/ijms222212412.