Внутривидовая дифференциация штаммов Francisella tularensis методом мультилокусной полимеразной цепной реакции с учетом результатов в режиме реального времени

Цель – разработка способа внутривидовой дифференциации туляремийного микроба: подвиды tularensis (субпопуляции AI и AII), holarctica (биовары japonica, EryS/R), mediasiatica и novicida – с помощью мультилокусной ПЦР с учетом результатов в режиме реального времени. Материалы и методы. В работе использовали 48 штаммов Francisella tularensis различных подвидов, биоваров и субпопуляций. Внутривидовую принадлежность штаммов устанавливали на основании анализа вариабельности области дифференциации RD-1 методом ПЦР , гена sdhA – методом фрагментного секвенирования по Сэнгеру, диско-диффузионным методом с использованием дисков с эритромицином. Подбор праймеров и зондов проводили с помощью программного обеспечения на сайте www.genscript.com и программы GeneRunner 6.5.52. Оценку гомологии последовательностей – по алгоритму BLAST, используя базу данных GenBank NCBI. Результаты и обсуждение. Получены новые данные по структуре и встречаемости областей дифференциации RD-8, RD-12, RD-28, гена FTT1122с и гомологичных ему последовательностей у штаммов туляремийного микроба различной подвидовой принадлежности. Выявлена новая RDhm размером 346 п.н., характерная для штаммов subsp. mediasiatica, holarctica, которая делетирована у subsp. tularensis и отсутствует у subsp. novicida. На основе выявления локусов FTT1670, FTT1122с, FTT1067, FTW_2084 разработана мультилокусная ПЦР с учетом результатов в режиме реального времени «F. tularensis 4c», обеспечивающая определение всех подвидов туляремийного микроба, отдельно биовара japonica голарктического подвида и субпопуляций АI, AII подвида tularensis. Подтверждена ее специфичность при исследовании штаммов туляремийного микроба из фонда Государственной коллекции патогенных бактерий ФКУН Российский противочумный институт «Микроб». Полученные результаты расширяют представление о внутривидовой генетической неоднородности туляремийного микроба и возможности идентификации возбудителя туляремии с помощью молекулярно-генетических методов. Они также важны для понимания процессов приспособления возбудителя к циркуляции в макроорганизме и объектах окружающей среды, направлений эволюции и образования новых видов франциселл.

1. List of Procariotic names with Standing in Nomenclature (LPSN). [Электронный ресурс]. URL: http://www.bacterio.net/francisella.html (дата обращения 15.01.2023).

2. Molins-Schneekloth C.R., Belisle J.T., Petersen J.M. Genomic markers for differentiation of Francisella tularensis subsp. tularensis AI and AII strains. Appl. Environ. Microbiol. 2008; 74(1):336–41. DOI: 10.1128/AEM.01522-07.

3. Gunnell M.K., Lovelace C.D., Satterfield B.A., Moore E.A., O’Neill K.L., Robison R.A. A multiplex real-time PCR assay for the detection and differentiation of Francisella tularensis subspecies. J. Med. Microbiol. 2012; 61(Pt. 1):1525–31. DOI: 10.1099/jmm.0.046631-0.

4. Tomaso H., Scholz H.C., Neubauer H., Al Dahouk S., Seibold E., Landt O., Forsman M., Splettstoesser W.D. Real-time PCR using hybridization probes for the rapid and specific identification of Francisella tularensis subspecies tularensis. Mol. Cell. Probes. 2007; 21(1):12–6. DOI: 10.1016/j.mcp.2006.06.001.

5. WHO. Guidelines on Tularaemia. WHO Press; 2007. 115 p.

6. Woubit A., Yehualaeshet T., Habtemariam T., Samuel T. Novel genomic tools for specific and real-time detection of biothreat and frequently encountered food-borne pathogens. J. Food Prot. 2012; 75(4):660–70. DOI: 10.4315/0362-028X.JFP-11-480.

7. Broekhuijsen M., Larsson P., Johansson A., Byström M., Eriksson U., Larsson E., Prior R.G., Sjöstedt A., Titball R.W., Forsman M. Genome-wide DNA microarray analysis of Francisella tularensis strains demonstrates extensive genetic conservation within the species but identifies regions that are unique to the highly virulent F. tularensis subsp. tularensis. J. Clin. Microbiol. 2003; 41(7):2924–31. DOI: 10.1128/JCM.41.7.2924-2931.2003.

8. Осина Н.А., Мошкова М.С., Уткин Д.В., Ляшова О.Ю., Куличенко А.Н. Идентификация подвидов туляремийного микроба методом мультиплексной полимеразной цепной реакции. Проблемы особо опасных инфекций. 2007; 1:92–3.

9. Вахрамеева Г.М., Лапин А.А., Павлов В.М., Мокриевич А.Н., Миронова Р.И., Дятлов И.А. ПЦР -дифференциация подвидов Francisella tularensis с помощью одного праймера. Проблемы особо опасных инфекций. 2011; 1:46–8. DOI: 10.21055/0370-1069-2011-1(107)-46-48.

10. Larson M.A., Sayood K., Bartling A.M., Meyer J.R., Starr C., Baldwin J., Dempsey M.P. Differentiation of Francisella tularensis subspecies and subtypes. J. Clin. Microbiol. 2020. 58(4):e01495-19. DOI: 10.1128/JCM.01495-19.

11. Birdsell D.N., Vogler A.J., Buchhagen J., Clare A., Kaufman E., Naumann A., Driebe E., Wagner D.M., Keim P.S. TaqMan realtime PCR assays for single-nucleotide polymorphisms which identify Francisella tularensis and its subspecies and subpopulations. PLoS One. 2014; 9(9):e107964. DOI: 10.1371/journal.pone.0107964.

12. Сорокин В.М., Водопьянов А.С., Цимбалистова М.В., Павлович Н.В. Дифференциация подвидов Francisella tularensis методом INDEL-типирования. Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунологии. 2022; 99(2):193–202. DOI: 10.36233/0372-9311-189.

13. Champion M.D., Zeng Q., Nix E.B., Nano F.E., Keim P., Kodira C.D., Borowsky M., Young S., Koehrsen M., Engels R., Pearson M., Howarth C., Larson L., White J., Alvarado L., Forsman M., Bearden S.W., Sjöstedt A., Titball R., Michell S.L., Birren B., Galagan J. Comparative genomic characterization of Francisella tularensis strains belonging to low and high virulence subspecies. PLoS Pathog. 2009; 5(5):e1000459. DOI: 10.1371/journal.ppat.1000459.

14. Rohmer L., Fong C., Abmayr S., Wasnick M., Larson Freeman T.J, Radey M., Guina T., Svensson K., Hayden H.S., Jacobs M., Gallagher L.A., Manoil C., Ernst R.K., Drees B., Buckley D., Haugen E., Bovee D., Zhou Y., Chang J., Levy R., Lim R., Gillett W., Guenthener D., Kang A., Shaffer S.A., Taylor G., Chen J., Gallis B., D’Argenio D.A., Forsman M., Olson M.V., Goodlett D.R., Kaul R., Miller S.I., Brittnacher M.J. Comparison of Francisella tularensis genomes reveals evolutionary events associated with the emergence of human pathogenic strains. Genome Biol. 2007; 8(6):R102. DOI: 10.1186/gb-2007-8-6-r102.

15. LeButt H. The Construction and Use of a Francisella tularensis DNA Microarray. PhD thesis The Open University. 2008. DOI: 10.21954/ou.ro.0000fd6f.

16. Sarva S.T., Waldo R.H., Belland R.J., Klose K.E. Comparative transcriptional analyses of Francisella tularensis and Francisella novicida. PLoS One. 2016; 11(8):e0158631. DOI: 10.1371/journal. pone.0158631.

17. Samrakandi M.M., Zhang C., Zhang M., Nietfeldt J., Kim J., Iwen P.C., Olson M.E., Fey P.D., Duhamel G.E., Hinrichs S.H., Cirillo J.D., Benson A.K. Genome diversity among regional populations of Francisella tularensis subspecies tularensis and Francisella tularensis subspecies holarctica isolated from the US. FEMS Microbiol. Lett. 2004; 237(1):9–17. DOI: 10.1016/j.femsle.2004.06.008.

18. Johansson A., Farlow J., Larsson P., Dukerich M., Chambers E., Byström M., Fox J., Chu M., Forsman M., Sjöstedt A., Keim P. Worldwide genetic relationships among Francisella tularensis isolates determined by multiple-locus variable-number tandem repeat analysis. J. Bacteriol. 2004; 186(17):5808–18. DOI: 10.1128/JB.186.17.5808–5818.2004.

19. Chandler J.C., Molins C.R., Petersen J.M., Belisle J.T. Differential chitinase activity and production within Francisella species, subspecies, and subpopulations. J. Bacteriol. 2011; 193(13):3265–75. DOI: 10.1128/JB.00093-11.

20. Осина Н.А., Уткин Д.В., Сеничкина А.М., Бугоркова Т.В., Кутырев В.В. Набор штаммов бактерий вида Francisella tularensis для получения комплекта контрольных ДНК препаратов, комплект ДНК препаратов для генно-диагностических исследований. Патент РФ № 2443772, опубл. 27.02.2012. Бюл. № 6.

21. Barns S.M., Grow C.C., Okinaka R.T., Keim P., Kuske C.R. Detection of diverse new Francisella-like bacteria in environmental samples. Appl. Environ. Microbiol. 2005; 71(9):5494–500. DOI: 10.1128/AEM.71.9.5494-5500.2005.

22. Berrada Z.L., Telford S.R. Diversity of Francisella species in environmental samples from Martha’s Vineyard, Massachusetts. Microb. Ecol. 2010; 59(2):277–83. DOI: 10.1007/s00248-009-9568-y.