Типирование некультивируемых изолятов Coxiella burnetii и Coxiella-подобных микроорганизмов, ассоциированных с клещами, с применением анализа нуклеотидной последовательности гена 16S рРНК

Возбудитель Ку-лихорадки – внутриклеточный патоген Coxiella burnetii – распространен практически по всему миру; в его циркуляции участвует множество видов кровососущих клещей, опасных для животных и человека. С помощью молекулярно-генетических методов обнаружены близкородственные виды микроорганизмов рода Coxiella sp., ряд которых является эндосимбионтами клещей, а некоторые могут выживать в организме человека, вызывая инфекционный процесс. Существование видов, гены которых по нуклеотидной последовательности сходны с генами C. burnetii, затрудняет генодиагностику патогена у членистоногих переносчиков. Цель данной работы – изучение возможности применения ПЦР для молекулярной диагностики и секвенирования протяженного фрагмента гена 16S рРНК для дифференциации C. burnetii от Coxiella-подобных микроорганизмов. Материалы и методы. Индивидуальные пробы кровососущих клещей исследовали для обнаружения бактерий рода Coxiella sp. с помощью стандартной ПЦР. Для положительных образцов получали протяженные фрагменты гена 16S рРНК и исследовали его с помощью секвенирования и множественного выравнивания с гомологичными последовательностями. Результаты и обсуждение. Из 96 исследованных клещей, собранных на территории Ульяновской области, один был положителен на присутствие ДНК C. burnetii и один – на присутствие ДНК Coxiella sp. Для изолята C. burnetii наибольшее сходство выявлено с западноевропейскими штаммами, для Coxiella-подобного микроорганизма – с близкородственными бактериями из клещей того же вида. Отмечены уникальные полиморфизмы для обнаруженных микроорганизмов. Установлено, что родоспецифичные праймеры к фрагменту гена 16S рРНК способны амплифицировать не только бактерии рода Coxiella sp., но и генетически дистанцированные виды. Анализ последовательности протяженного фрагмента гена 16S рРНК позволяет дифференцировать C. burnetii от Coxiella-подобных микроорганизмов; некоторые полиморфизмы гена, по-видимому, возникли в процессе микроэволюции в различных географических регионах. В европейской части Российской Федерации Coxiella-подобные бактерии обнаружены впервые.

1. Spitalska E., Kocianova E. Tick-borne microorganisms in southwestern Slovakia. Ann. N. Y. Acad. Sci. 2003; 990:196–200. DOI: 10.1111/j.1749-6632.2003.tb07362.x.

2. Mediannikov O., Ivanov L., Nishikawa M., Saito R., Sidelnikov Y.N., Zdanovskaya N.I., Tarasevich I.V., Suzuki H. Molecular evidence of Coxiella-like microorganism harbored by Haemaphysalis concinnae ticks in the Russian Far East. Ann. N. Y. Acad. Sci. 2003; 990:226–8. DOI: 10.1111/j.1749-6632.2003.tb07367.x.

3. Lee J.H., Park H.S., Jang W.J., Koh S.E., Park T.K., Kang S.S., Kim B.J., Kook Y.H., Park K.H., Lee S.H. Identification of the Coxiella sp. detected from Haemaphysalis longicornis ticks in Korea. Microbiol. Immunol. 2004; 48(2):125–30. DOI: 10.1111/j.1348-0421.2004.tb03498.x.

4. Zhong J. Coxiella-like endosymbionts. Adv. Exp. Med. Biol. 2012; 984:365–79. DOI: 10.1007/978-94-007-4315-1_18.

5. Guimard T., Amrane S., Prudent Е., El Karkouri K., Raoult D., Angelakis E. Case report: Scalp eschar and neck lymphadenopathy associated with bacteremia due to Coxiella-like bacteria. Am. J. Trop. Med. Hyg. 2017; 97(5):1319–22. DOI: 10.4269/ajtmh.17-0251.

6. Duron O. The IS1111 insertion sequence used for detection of Coxiella burnetii is widespread in Coxiella-like endosymbionts of ticks. FEMS Microbiol. Lett. 2015; 362(17):fnv132. DOI: 10.1093/femsle/fnv132.

7. Duron O., Jourdain E., McCoy K.D. Diversity and global distribution of the Coxiella intracellular bacterium in seabird ticks. Ticks Tick Borne Dis. 2014; 5(5):557–63. DOI: 10.1016/j.ttbdis.2014.04.003.

8. Špitalská E., Sparagano O., Stanko M., Schwarzová K., Špitalský Z., Škultéty L., Havlíková S.F. Diversity of Coxiella-like and Francisella-like endosymbionts, and Rickettsia spp., Coxiella burnetii as pathogens in the tick populations of Slovakia, Central Europe. Ticks Tick Borne Dis. 2018; 9(5):1207–11. DOI: 10.1016/j.ttbdis.2018.05.002.

9. Machado-Ferreira E., Vizzoni V.F., Balsemão-Pires E., Moerbeck L., Gazeta G.S., Piesman J., Voloch C.M., Soares C.A. Coxiella symbionts are widespread into hard ticks. Parasitol. Res. 2016; 115(12):4691–9. DOI: 10.1007/s00436-016-5230-z.

10. McLaughlin H.P., Cherney B., Hakovirta J.R., Priestley R.A., Conley A., Carter A., Hodge D., Pillai S.P., Weigel L.M., Kersh G.J., Sue D. Phylogenetic inference of Coxiella burnetii by 16S rRNA gene sequencing. PLoS One. 2017; 12(12):e0189910. DOI: 10.1371/journal.pone.0189910.

11. Филиппова Н.А. Иксодовые клещи подсемейства Ixodinae. Фауна СССР . Паукообразные. Т. 4. Вып. 4. Л.: Наука; 1977. 396 с.

12. Masuzawa T., Sawaki K., Nagaoka H., Akiyama M., Hirai K., Yanagihara Y. Identification of rickettsiae isolated in Japan as Coxiella burnetii by 16S rRNA sequencing. Int. J. Syst. Bacteriol. 1997; 47(3):883–4. DOI: 10.1099/00207713-47-3-883.

13. Okonechnikov K., Golosova O., Fursov M.; UGENE team. Unipro UGENE: a unified bioinformatics toolkit. Bioinformatics. 2012; 28(8):1166–7. DOI: 10.1093/bioinformatics/bts091.

14. Leclerque A., Kleespies R.G. 16S rRNA-, GroEL- and MucZ-based assessment of the taxonomic position of ‘Rickettsiella melolonthae’ and its implications for the organization of the genus Rickettsiella. Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 2008; 58(Pt. 4):749–55. DOI: 10.1099/ijs.0.65359-0.

15. Gottlieb Y., Lalzar I., Klasson L. Distinctive genome reduction rates revealed by genomic analyses of two Coxiella-like endosymbionts in ticks. Genome Biol. Evol. 2015; 7(6):1779–96. DOI: 10.1093/gbe/evv108.

16. Mehari Y.T., Jason Hayes B., Redding K.S., Mariappan P.V.G., Gunderson J.H., Farone A.L., Farone M.B. Description of ‘Candidatus Berkiella aquae’ and ‘Candidatus Berkiella cookevillensis’, two intranuclear bacteria of freshwater amoebae. Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 2016; 66(2):536–41. DOI: 10.1099/ijsem.0.000750.

17. Bojko J., Dunn A.M., Stebbing P.D., van Aerle R., Bacela-Spychalska K., Bean T.P., Urrutia A., Stentiford G.D. ‘Candidatus Aquirickettsiella gammari’ (Gammaproteobacteria: Legionellales: Coxiellaceae): A bacterial pathogen of the freshwater crustacean Gammarus fossarum (Malacostraca: Amphipoda). J. Invertebr. Pathol. 2018; 156:41–53. DOI: 10.1016/j.jip.2018.07.010.

18. Papa A., Tsioka K., Kontana A., Papadopoulos C., Giadinis N. Bacterial pathogens and endosymbionts in ticks. Ticks Tick Borne Dis. 2017; 8(1):31–5. DOI: 10.1016/j.ttbdis.2016.09.011.

19. Лубова В.А., Леонова Г.Н., Шутикова А.Л., Бондаренко Е .И. Индикация возбудителя Ку-лихорадки на юге Дальнего Востока. Клиническая лабораторная диагностика. 2020; 65(11):724–8. DOI: 10.18821/0869-2084-2020-65-724-728.