Сравнительный молекулярно-генетический анализ штаммов Francisella tularensis, изолированных в Ростовской области в 2020 г., и последовательностей геномов штаммов, выделенных в различных регионах мира

В 2020 г. при проведении эпизоотологического мониторинга в очаге степного типа на юго-востоке Ростовской области на фоне разлитой эпизоотии в популяциях обыкновенной полевки Microtus arvalis obscurus и общественной полевки Microtus socialis изолировано шесть культур туляремийного микроба от павших и отловленных живыми животных.

Цель работы состояла в разработке схемы SNP-типирования и сравнительном изучении филогенетических связей штаммов Francisella tularensis, изолированных в Ростовской области (2020 г.), со штаммами из других регионов.

Материалы и методы. Полногеномное секвенирование проводили на платформе MiSeq Illumina. Для анализа применяли авторское программное обеспечение GeneExpert, PrimerM и VirtualPCR, написанное на языке программирования Java.

Результаты и обсуждение. Штаммы возбудителя туляремии, выделенные на территории Ростовской области в 2020 г., можно распределить между двумя различными кластерами. Установлено, что два штамма возбудителя туляремии (F0884 и F0889), выделенные на территории Турции, генетически близки к некоторым изолятам, циркулирующим в Ростовской области. Выявлен уникальный INDEL-маркер, характерный для данной группы штаммов. Проведенное сравнение предлагаемой нами схемы типирования со схемой «канонических» SNP показало довольно хорошее схождение результатов в пределах больших кластеров, при этом использование набора из 6626 SNP позволяет дифференцировать штаммы внутри одного canSNP-типа. Выявлено, что вакцинный штамм имеет общий canSNP-тип с клиническими и природными штаммами. Подобран набор SNP-маркеров для проведения сравнительного анализа. Обнаружен новый INDEL-маркер, позволяющий проводить внутривидовое типирование F. tularensis, и доказана возможность его использования in vitro и in silico.

1. Skottman T., Piiparinen H., Hyytiäinen H., Myllys V., Skurnik M., Nikkari S. Simultaneous real-time PCR detection of Bacillus anthracis, Francisella tularensis and Yersinia pestis. Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. 2007; 26(3):207–11. DOI: 10.1007/s10096-007-0262-z.

2. Кудрявцева Т.Ю., Попов В.П., Мокриевич А.Н., Куликалова Е.С., Холин А.В., Мазепа А.В., Транквилевский Д.В., Храмов М.В., Дятлов И.А. Эпизоотолого-эпидемиологическая ситуация по туляремии на территории России в 2020 г., прогноз на 2021 г. Проблемы особо опасных инфекций. 2021; 1:32–42. DOI: 10.21055/0370-1069-2021-1-32-42.

3. Sissonen S., Rossow H., Karlsson E., Hemmilä H., Henttonen H., Isomursu M., Kinnunen P.M., Pelkola K., Pelkonen S., Tarkka E., Myrtennäs K., Nikkari S., Forsman M. Phylogeography of Francisella tularensis subspecies holarctica in Finland, 1993–2011. Infect. Dis. (Lond). 2015; 47(10):701–6. DOI: 10.3109/23744235.2015.1049657.

4. Водопьянов А.С., Павлович Н.В., Водопьянов С.О., Сучков И.Ю., Пичурина Н.Л., Мишанькин Б.Н. Генотипирование методом мультилокусного VNTR-анализа штаммов Francisella tularensis, выделенных из природных очагов туляремии Ростовской области. Молекулярная генетика, микробиология и вирусология. 2004; 2:24–8.

5. Водопьянов А.С., Мишанькин Б.Н., Павлович Н.В., Водопьянов С.О., Сучков И.Ю. VNTR-генотипирование штаммов Francisella tularensis, выделенных на территории бывшего СССР и некоторых стран Европы во время эпизоотий 1988–1989 годов. Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. 2006; 3:22–7.

6. Pandya G.A., Holmes M.H., Petersen J.M., Pradhan S., Karamycheva S.A., Wolcott M.J., Molins C., Jones M., Schriefer M.E., Fleischmann R.D., Peterson S.N. Whole genome single nucleotide polymorphism based phylogeny of Francisella tularensis and its application to the development of a strain typing assay. BMC Microbiol. 2009; 9:213. DOI: 10.1186/1471-2180-9-213.

7. Vogler A.J., Birdsell D., Price L.B., Bowers J.R., Beckstrom-Sternberg S.M., Auerbach R.K., Beckstrom-Sternberg J.S., Johansson A., Clare A., Buchhagen J.L., Petersen J.M., Pearson T., Vaissaire J., Dempsey M.P., Foxall P., Engelthaler D.M., Wagner D.M., Keim P. Phylogeography of Francisella tularensis: global expansion of a highly fit clone. J. Bacteriol. 2009; 191(8):2474–84. DOI: 10.1128/JB.01786-08.

8. Karlsson E., Svensson K., Lindgren P., Byström M., Sjödin A., Forsman M., Johansson A. The phylogeographic pattern of Francisella tularensis in Sweden indicates a Scandinavian origin of Eurosiberian tularaemia. Environ. Microbiol. 2013; 15(2):634–45. DOI: 10.1111/1462-2920.12052.

9. Kevin M., Girault G., Caspar Y., Cherfa M.A., Mendy C., Tomaso H., Gavier-Widen D., Escudero R., Maurin M., Durand B., Ponsart C., Madani N. Phylogeography and genetic diversity of Francisella tularensis subsp. holarctica in France (1947–2018). Front. Microbiol. 2020; 11:287. DOI: 10.3389/fmicb.2020.00287.

10. Кудрявцева Т.Ю., Мокриевич А.Н. Молекулярно-генетические основы различий подвидов возбудителя туляремии и типирования штаммов Francisella tularensis subsp. holarctica. Молекулярная генетика, микробиология и вирусология. 2022; 40(1):12–20. DOI: 10.17116/molgen20224001112.

11. Bankevich A., Nurk S., Antipov D., Gurevich A.A., Dvorkin M., Kulikov A.S., Lesin V.M., Nikolenko S.I., Pham S., Prjibelski A.D., Pyshkin A.V., Sirotkin A.V., Vyahhi N., Tesler G., Alekseyev M.A., Pevzner P.A. SPAdes: a new genome assembly algorithm and its applications to single-cell sequencing. J. Comput. Biol. 2012; 19(5):455–77. DOI: 10.1089/cmb.2012.0021.

12. Tamura K., Peterson D., Peterson N., Stecher G., Nei M., Kumar S. MEGA5: molecular evolutionary genetics analysis using maximum likelihood, evolutionary distance, and maximum parsimony methods. Mol. Biol. Evol. 2011; 28(10):2731–9. DOI: 10.1093/molbev/msr121.

13. Lärkeryd A., Myrtennäs K., Karlsson E., Dwibedi C.K., Forsman M., Larsson P., Johansson A., Sjödin A. CanSNPer: a hierarchical genotype classifier of clonal pathogens. Bioinformatics. 2014; 30(12):1762–4. DOI: 10.1093/bioinformatics/btu113.

14. Водопьянов А.С., Писанов Р.В., Водопьянов С.О., Олейников И.П. Совершенствование методики SNP-типирования штаммов Vibrio cholerae на основе анализа первичных данных полногеномного секвенирования. Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. 2020; 97(6):587–93. DOI: 10.36233/0372-9311-2020-97-6-9.

15. Нарышкина Е.А., Краснов Я.М., Альхова Ж.В., Баданин Д.В., Осин А.В., Ляшова О.Ю., Саяпина Л.В., Бондарев В.П., Меркулов В.А., Олефир Ю.В., Кутырев В.В. Полногеномное секвенирование и филогенетический анализ вакцинного штамма Francisella tularensis 15 НИИЭГ . Проблемы особо опасных инфекций. 2020; 2:91–7. DOI: 10.21055/0370-1069-2020-2-91-97.

16. Цимбалистова М.В., Сорокин В.М., Аронова Н.В., Анисимова А.С., Пичурина Н.Л., Пасюкова Н.И., Селянская Н.А., Водопьянов С.О., Водопьянов А.С., Писанов Р.В., Павлович Н.В., Ковалев Е.В., Носков А.К. Биологические свойства и генетическая характеристика штаммов Francisella tularensis, изолированных на территории Ростовской области в 2020 г. Проблемы особо опасных инфекций. 2021; 3:134–40. DOI: 10.21055/0370-1069-2021-3-134-140.