Алкилсульфатаза холерных вибрионов

Цель работы – изучение структуры гена алкилсульфатазы (asu) у штаммов Vibrio cholerae различных серогрупп, а также сравнение нуклеотидных и аминокислотных последовательностей алкилсульфатаз с использованием различных методов биоинформационного анализа.

Материалы и методы. В работе использовали 483 штамма V. cholerae серогрупп О1, О139 и nonO1/nonO139. Поиск гена, его копийность и локализацию проводили с помощью программы Blast. Нуклеотидную и соответствующую аминокислотную последовательности гена, а также его структуру изучали с помощью биоинформационного анализа. Секвенирование проводили на платформе MiSeq (Illumina). Ферментативную активность детектировали с использованием среды, подтверждая наличие/отсутствие гена методом ПЦР in vitro и in silico.

Результаты и обсуждение. Проведен биоинформационный анализ нуклеотидной и соответствующей аминокислотной последовательностей гена asu и изучена его структура. В структуре гена выявлено четыре функциональных домена. В бета-лактамазном домене обнаружена консервативная аминокислотная последовательность -HAHADH- у всех штаммов холерных вибрионов, входящая в Zn²⁺-связывающий мотив. Установлено, что алкилсульфатаза холерных вибрионов относится к семейству Zn²⁺-зависимых-β-лактамаз. Blast-анализ выявил сходство нуклеотидных и аминокислотных последовательностей алкилсульфатаз представителей V. cholerae серогрупп O1 и O139 (ctxAB⁺tcpA⁺) с представителями родов Aeromonas и Pseudomonas, что совпало с данными 3D-моделирования структур аминокислотных последовательностей фермента алкилсульфатазы у этих микроорганизмов. Биоинформационный анализ нуклеотидных и аминокислотных последовательностей алкилсульфатаз у холерных вибрионов выявил их консервативность у токсигенных штаммов и наличие ряда единичных мутаций в гене asu у атоксигенных. Наличие или отсутствие гена asu установлено методом ПЦР in vitro и in silico и подтверждено результатами, полученными с помощью программы Blast. Продемонстрировано, что наличие/отсутствие гена asu коррелирует со способностью/неспособностью штаммов О139-серогруппы гидролизовать додецилсульфат натрия (SDS) на среде. Эти данные могут быть использованы в изучении механизмов, лежащих в основе адаптации/персистенции и патогенности холерных вибрионов.

1. Валышев А.В., Валышева Н.А. Разрушение анионного поверхностно-активного вещества (додецилсульфата натрия) микроорганизмами окружающей среды. Бюллетень Оренбургского научного центра УрО РАН. 2018; 4. 4 с. [Электронный ресурс]. URL: http://elmag.uran.ru:9673/magazine/Numbers/2018-4/Articles/VAV-2018-4.pdf (дата обращения 21.12.2022). DOI: 10.24411/2304-9081-2019-14023.

2. Sun L., Chen P., Su Y., Cai Z., Ruan L., Xu X., Wu Y. Crystal structure of thermostable alkylsulfatase SdsAP from Pseudomonas sp. S9. Biosci. Rep. 2017; 37(3):BSR20170001. DOI: 10.1042/BSR20170001.

3. Toesch M., Schober M., Faber K. Microbial alkyl- and arylsulfatases: mechanism, occurrence, screening and stereoselectivities. Appl. Microbiol. Biotechnol. 2014; 98(4):1485–96. DOI: 10.1007/s00253-013-5438-0.

4. Hanson S.R., Best M.D., Wong C.-H. Sulfatases: structure, mechanism, biological activity, inhibition, and synthetic utility. Angew Chem. Int. Ed. Engl. 2004; 43(43):5736–63. DOI: 10.1002/anie.200300632.

5. Shahbazi R., Kasra-Kermanshahi R., Gharavi S., Moosavi-Nejad Z., Borzooee F. Screening of SDS-degrading bacteria from car wash wastewater and study of the alkylsulfatase enzyme activity. Iran. J. Microbiol. 2013; 5(2):153–8.

6. Furmanczyk E.M., Lipinski L., Dziembowski A., Sobczak A. Genomic and functional characterization of environmental strains of SDS-degrading Pseudomonas spp., providing a source of new sulfatases. Front. Microbiol. 2018; 9:1795. DOI: 10.3389/fmicb.2018.01795.

7. Дуванова О.В., Водопьянов С.О., Мишанькин Б.Н., Писанов Р .В. Алкилсульфатаза холерных вибрионов О1 и О139 серогрупп. В кн.: Холера и патогенные для человека вибрионы: Сборник статей Проблемной комиссии. Вып. 24. Ростов н/Д; 2011. С. 84–6.

8. Дуванова О.В., Мишанькин Б.Н., Водопьянов С.О., Писанов Р .В. Способ дифференциации штаммов Vibrio cholerae О139 серогруппы по алкилсульфатазной активности. Патент РФ № 2473697, опубл. 27.01.2013. Бюл. № 3.

9. Водопьянов А.С., Водопьянов С.О., Мишанькин Б.Н., Олейников И .П. Алгоритм компьютерного VNTR-типирования на основе неполных сиквенсов ДНК -штаммов Vibrio cholerae, выделенных на Гаити в 2010 г. Здоровье населения и среда обитания. 2013; 3:28–30.

10. Yang X., Liu D., Liu F., Wu J., Zou J., Xiao X., Zhao F., Zhu B. HTQC: a fast quality control toolkit for Illumina sequencing data. BMC Bioinformatics. 2013; 14:33. DOI: 10.1186/1471-2105-14-33.

11. Bolger A.M., Lohse M., Usadel B. Trimmomatic: a flexible trimmer for Illumina sequence data. Bioinformatics. 2014; 30(15):2114–20. DOI: 10.1093/bioinformatics/btu170.

12. Bankevich A., Nurk S., Antipov D., Gurevich A.A., Dvorkin M., Kulikov A.S., Lesin V.M., Nikolenko S.I., Pham S., Prjibelski A.D., Pyshkin A.V., Sirotkin A.V., Vyahhi N., Tesler G., Alekseyev M.A., Pevzner P.A. SPAdes: a new genome assembly algorithm and its applications to single-cell sequencing. J. Comput. Biol. 2012; 19(5):455–77. DOI: 10.1089/cmb.2012.0021.

13. Altschul S.F., Gish W., Miller W., Myers E.W., Lipman D.J. Basic local alignment search tool. J. Mol. Biol. 1990; 215(3):403–10. DOI: 10.1016/S0022-2836(05)80360-2.

14. Katoh K., Misawa K., Kuma K., Miyata T. MAFFT: a novel method for rapid multiple sequence alignment based on fast Fourier transform. Nucleic Acids Res. 2002; 30(14):3059–66. DOI: 10.1093/nar/gkf436.

15. Price M.N., Dehal P.S., Arkin A.P. FastTree 2 – approximately maximum-likelihood trees for large alignments. PLoS One. 2010; 5(3):e9490. DOI: 10.1371/journal.pone.0009490.

16. Shannon P., Markiel A., Ozier O., Baliga N.S., Wang J.T., Ramage D., Amin N., Schwikowski B., Ideker T. Cytoscape: a software environment for integrated models of biomolecular interaction networks. Genome Res. 2003; 13(11):2498–504. DOI: 10.1101/gr.1239303.

17. Hagelueken G., Adams T.M., Wiehlmann L., Widow U., Kolmar H., Tümmler B., Heinz D.W., Schubert W.-D. The crystal structure of SdsA1, an alkilsulfatase from Pseudomonas aeruginosa, defines a third class of sulfatases. Proc. Natl Acad. Sci. USA. 2006; 103(20):7631–6. DOI: 10.1073/pnas.0510501103.

18. Luis A.S., Jin C., Pereira G.V., Glowacki R.W.P., Gugel S.R., Singh S., Byrne D.P., Pudlo N.A., London J.A., Baslé A., Reihill M., Oscarson S., Eyers P.A., Czjzek M., Michel G., Barbeyron T., Yates E.A., Hansson G.C., Karlsson N.G., Cartmell A., Martens E.C. A single sulfatase is required to access colonic mucin by a gut bacterium. Nature. 2021; 598(7880):332–7. DOI: 10.1038/s41586-021-03967-5.