Синтез генома бактериофага N4

В настоящее время бактериофаги рассматриваются как альтернатива антибиотикам для профилактики и терапии инфекционных заболеваний, вызываемых бактериями, в частности холеры.

Цель работы – продемонстрировать метод получения синтетического бактериофага, специфически активного в отношении Vibrio cholerae. В качестве объекта выбран вибриофаг N4.

Материалы и методы. Последовательность генома вибриофага N4 (38,5 тыс. п.о.) взята из базы данных NCBI GenBank. Последовательность была разбита на генные блоки (1500– 2000 п.о.). Генные блоки, в свою очередь, разбиты на олигонуклеотиды. Разбиение последовательности проводилось с помощью разработанного нами программного обеспечения BAC-browser. Олигонуклеотиды были химически синтезированы. Из них собраны генные блоки. Затем из полученных генных блоков синтезирован полный геном вибриофага N4. Сборка синтетического генома проходила в два этапа. На первом этапе получены кассеты генных блоков по 5–7 штук размером от 7 до 10,5 тыс. п.о. с помощью гомологичной рекомбинации в дрожжах. Затем полученные кассеты амплифицированы и использованы для сборки in vitro с помощью 5’-3’-экзонуклеазы и термостабильной ДНК-полимеразы. Полученный препарат использовался для электропорации клеток В настоящее время бактериофаги рассматриваются как альтернатива антибиотикам для профилактики и терапии инфекционных заболеваний, вызываемых бактериями, в частности холеры. Цель работы – продемонстрировать метод получения синтетического бактериофага, специфически активного в отношении Vibrio cholerae. В качестве объекта выбран вибриофаг N4. Материалы и методы. Последовательность генома вибриофага N4 (38,5 тыс. п.о.) взята из базы данных NCBI GenBank. Последовательность была разбита на генные блоки (1500– 2000 п.о.). Генные блоки, в свою очередь, разбиты на олигонуклеотиды. Разбиение последовательности проводилось с помощью разработанного нами программного обеспечения BAC-browser. Олигонуклеотиды были химически синтезированы. Из них собраны генные блоки. Затем из полученных генных блоков синтезирован полный геном вибриофага N4. Сборка синтетического генома проходила в два этапа. На первом этапе получены кассеты генных блоков по 5–7 штук размером от 7 до 10,5 тыс. п.о. с помощью гомологичной рекомбинации в дрожжах. Затем полученные кассеты амплифицированы и использованы для сборки in vitro с помощью 5’-3’-экзонуклеазы и термостабильной ДНК-полимеразы. Полученный препарат использовался для электропорации клеток V. cholerae. Результаты и обсуждение. Синтетический геном вибриофага N4 был доставлен с помощью электропорации в штамм V. cholerae M818 O1 биовар Эль Тор. В результате наблюдалось образование литических бляшек на газоне V. cholerae. Разработанный нами спектр технологий: программное обеспечение для дизайна сборок, ферменты и буферы для синтеза генных блоков и их сшивки методом гомологичной рекомбинации in vitro, метод получения сборок крупного размера в дрожжах – можно использовать для получения искусственных бактериофагов с рациональным дизайном генома. Ключевые слова: холера, бактериофаг, синтез генома.

Результаты и обсуждение. Синтетический геном вибриофага N4 был доставлен с помощью электропорации в штамм V. cholerae M818 O1 биовар Эль Тор. В результате наблюдалось образование литических бляшек на газоне V. cholerae. Разработанный нами спектр технологий: программное обеспечение для дизайна сборок, ферменты и буферы для синтеза генных блоков и их сшивки методом гомологичной рекомбинации in vitro, метод получения сборок крупного размера в дрожжах – можно использовать для получения искусственных бактериофагов с рациональным дизайном генома.

1. WHO Report. Cholera – Global situation. 2023. [Электронный ресурс]. URL: https://www.who.int/emergencies/diseaseoutbreak-news/item/2023-DON437.

2. Аноприенко А.О., Тюрина А.В., Гаевская Н.Е., Погожова М.П. Создание экспериментального профилактического препарата на основе холерных бактериофагов. Вестник биотехнологии и физико-химической биологии имени Ю.А. Овчинникова. 2020; 16(3):10–3.

3. Погожова М.П., Гаевская Н.Е., Водопьянов А.С., Писанов Р.В., Аноприенко А.О., Романова Л.В., Тюрина А.В. Биологические свойства и генетическая харктеристика экспериментальных диагностических бактериофагов Vibrio cholerae. Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. 2021; 98(3):290–7. DOI: 10.36233/0372-9311-39.

4. Smith H.O., Hutchison C.A. 3rd, Pfannkoch C., Venter J.C. Generating a synthetic genome by whole genome assembly: φX174 bacteriophage from synthetic oligonucleotides. Proc. Natl Acad. Sci. USA. 2003; 100(26):15440–5. DOI: 10.1073/pnas.2237126100.

5. Lartigue C., Vashee S., Algire M.A., Chuang R.-Y., Benders G.A., Ma L., Noskov V.N., Denisova E.A., Gibson D.G., Assad-Garcia N., Alperovich N., Thomas D.W., Merryman C., Hutchison C.A. 3rd, Smith H.O., Venter J.C., Glass J.I. Creating bacterial strains from genomes that have been cloned and engineered in yeast. Science. 2009; 325(5948):1693–6. DOI: 10.1126/science.1173759.

6. Cheng L., Deng Z., Tao H., Song W., Xing B., Liu W., Kong L., Yuan S., Ma Y., Wu Y., Huang X., Peng Y., Wong N.K., Liu Y., Wang Y., Shen Y., Li J., Xiao M. Harnessing stepping-stone hosts to engineer, select, and reboot synthetic bacteriophages in one pot. Cell Rep. Methods. 2022; 2(5):100217. DOI: 10.1016/j.crmeth.2022.100217.

7. Das M., Nandy R.K., Bhowmick T.S., Yamasaki S., Ghosh A., Nair G.B., Sarkar B.L. Vibrio cholerae typing phage N4: genome sequence and its relatedness to T7 viral supergroup. Intervirology. 2012; 55(3):185–93. DOI: 10.1159/000323525.

8. Семашко Т.А., Фисунов Г.Ю., Цой Е.А., Харрасов Д.Р., Чудинов И.К., Евсютина Д.В., Шевелёв Г.Ю., Говорун В.М. Современные подходы к de novo синтезу протяженных фрагментов ДНК: сборка широкого репертуара последовательностей. Acta Naturae. 2024; 16(1).

9. Ito H., Fukuda Y., Murata K., Kimura A. Transformation of intact yeast cells treated with alkali cations. J. Bacteriol. 1983; 153(1):163–8. DOI: 10.1128/jb.153.1.163-168.1983.

10. Gonzales M.F., Brooks T., Pukatzki S.U., Provenzano D. Rapid protocol for preparation of electrocompetent Escherichia coli and Vibrio cholerae. J. Vis. Exp. 2013; (80):6–11. DOI: 10.3791/50684.

11. Литусов Н.В. Бактериофаги: иллюстрированное учебное пособие. Екатеринбург: УГМА; 2012. 38 с.

12. Tamanoi F., Saito H., Richardson C.C. Physical mapping of primary and secondary origins of bacteriophage T7 DNA replication. Proc. Natl Acad. Sci. USA. 1980; 77(5):2656–60. DOI: 10.1073/pnas.77.5.2656.

13. Garanina I.A., Fisunov G.Y., Govorun V.M. BACBROWSER: The tool for visualization and analysis of prokaryotic genomes. Front. Microbiol. 2018; 9:2827. DOI: 10.3389/fmicb.2018.02827.

14. Hutchison C.A. 3rd, Chuang R.Y., Noskov V.N., Assad-Garcia N., Deerinck T.J., Ellisman M.H., Gill J., Kannan K., Karas B.J., Ma L., Pelletier J.F., Qi Z.Q., Richter R.A., Strychalski E.A., Sun L., Suzuki Y., Tsvetanova B., Wise K.S., Smith H.O., Glass J.I., Merryman C., Gibson D.G., Venter J.C. Design and synthesis of a minimal bacterial genome. Science. 2016; 351(6280):aad6253. DOI: 10.1126/science.aad6253.

15. BioXpTM 3200 System: User’s Guide. No. 40010. P. 1–25.

16. Gibson D.G., Glass J.I., Lartigue C., Noskov V.N., Chuang R.Y., Algire M.A., Benders G.A., Montague M.G., Ma L., Moodie M.M., Merryman C., Vashee S., Krishnakumar R., Assad-Garcia N., Andrews-Pfannkoch C., Denisova E.A., Young L., Qi Z.Q., Segall-Shapiro T.H., Calvey C.H., Parmar P.P., Hutchison C.A. 3rd, Smith H.O., Venter J.C. Creation of a bacterial cell controlled by a chemically synthesized genome. Science. 2010; 329(5987):52–6. DOI: 10.1126/science.1190719.

17. Xia Y., Li K., Li J., Wang T., Gu L., Xun L. T5 exonucleasedependent assembly offers a low-cost method for efficient cloning and site-directed mutagenesis. Nucleic Acids Res. 2019; 47(3):e15. DOI: 10.1093/nar/gky1169.

18. Dao V.L., Chan S., Zhang J., Ngo R.K.J., Poh C.L. Single 3’-exonuclease-based multifragment DNA assembly method (SENAX). Sci. Rep. 2022; 12(1):4004. DOI: 10.1038/s41598-02207878-x.

19. Заднова С.П., Плеханов Н.А., Спирина А.Ю., Челдышова Н.Б. Анализ антифаговых систем в штаммах Vibrio cholerae O1 биовара Эль Тор. Здоровье населения и среда обитания – ЗНИСО. 2023; 31(11):94–100. DOI: 10.35627/2219-5238/2023-31-11-94-100.

20. Wood D.E., Lu J., Langmead B. Improved metagenomic analysis with Kraken 2. Genome Biol. 2019; 20(1):257. DOI: 10.1186/s13059-019-1891-0.

21. Liu Y., Han Y., Huang W., Duan Y., Mou L., Jiang Z., Fa P., Xie J., Diao R., Chen Y., Ye Y., Yang R., Chen J., Sun X., Li Z., Tang A., Gui Y., Cai Z. Whole-genome synthesis and characterization of viable S13-like bacteriophages. PLoS One. 2012; 7(7):e41124.

22. Yang R., Han Y., Ye Y., Liu Y., Jiang Z., Gui Y., Cai Z. Chemical synthesis of bacteriophage G4. PLoS One. 2011; 6(11):e27062. DOI: 10.1371/journal.pone.0027062.