Встречаемость у природных штаммов туляремийного микроба генетических детерминант, ассоциированных с аттенуацией

Цель работы – определение генетических маркеров, ассоциированных с аттенуацией (делеции в RD-18, RD‑19, единичные мутации), у природных штаммов возбудителя туляремии. Материалы и методы. В работе использованы 107 штаммов Francisella tularensis из Государственной коллекции патогенных бактерий ФКУН Российский противочумный институт «Микроб» Роспотребнадзора, а также 1077 геномов F. tularensis из базы данных NCBI GenBank. Культивирование осуществляли на чашках Петри с FT-агаром (ФБУН ГНЦ ПМБ), рН 7,2, посевы инкубировали в течение 36–48 ч при температуре (37±1) °С. Сборку чернового генома осуществляли с помощью пакета программ Unicycler v.0.4.7. С использованием программы snippy v.4.6.0 получена матрица из коровых SNPs. Дендрограмму получали в программе PhyML методом Likelihood c моделью замен GTR. Результаты и обсуждение. Среди изученных штаммов туляремийного микроба выявлено 11 эритромицин-резистентных штаммов F. tularensis филогенетических групп B.12 B.24 и B.12 B.20, содержащих делеции в областях RD-18 и RD-19. Также определены эритромицин-резистентные и эритромицин-чувствительные культуры патогена групп B.12 B.24, B.12 B.20, B.12 B.39 и B.4, B.6 B.10, B.6 B.7 соответственно, имеющие делецию только в области RD-18 – 11 штаммов, и только в RD-19 – 8. Из 11 культур, имеющих делеции в обеих областях, 9 относились к филогенетической группе B.12 B.24 и формировали отдельный кластер, оставшиеся две – к B.12 B.20. Для кластера таких штаммов характерно наличие семи уникальных мутаций, ассоциированных с формированием липолисахарида, метаболизмом ароматических соединений и размножением в макрофагах. У штаммов группы B.12 B.24 выявлены три дополнительные специфичные мутации. Нами определены 29 штаммов возбудителя туляремии (вакцинные, их производные и природные), несущие в разном количестве генетические маркеры, ассоциированные с аттенуацией.

1. Karlsson E., Golovliov I., Lärkeryd A., Granberg M., Larsson E., Öhrman C., Niemcewicz M., Birdsell D., Wagner D.M., Forsman M., Johansson A. Clonality of erythromycin resistance in Francisella tularensis. J. Antimicrob. Chemother. 2016; 71(10):2815–23. DOI: 10.1093/jac/dkw235.

2. Colquhoun D.J., Larsson P., Duodu S., Forsman M. The family Francisellaceae. In: Rosenberg E., DeLong E.F., Lory S., Stackebrandt E., Thompson F., editors. The Prokaryotes. Gammaproteobacteria. Berlin, Heidelberg: Springer; 2014. P. 287–314. DOI: 10.1007/978-3-642-38922-1_236.

3. Кудрявцева Т.Ю., Попов В.П., Мокриевич А.Н., Куликалова Е.С., Холин А.В., Мазепа А.В., Борзенко М.А., Черепанова Е.А., Матвеева В.А., Транквилевский Д.В., Храмов М.В., Дятлов И.А. Анализ эпизоотологической и эпидемиологической ситуации по туляремии на территории Российской Федерации в 2023 г. и прогноз на 2024 г. Проблемы особо опасных инфекций. 2024; (1):17–29. DOI: 10.21055/0370-1069-2024-1-17-29.

4. Кутырев В.В., Девдариани З.Л., Саяпина Л.В. Современное состояние научных исследований в области вакцинопрофилактики особо опасных бактериальных инфекций. Проблемы особо опасных инфекций. 2006; (2):18–24.

5. Саяпина Л.В., Бондарев В.П., Олефир Ю.В. Современное состояние вакцинопрофилактики особо опасных инфекций. Проблемы особо опасных инфекций. 2016; (2):107–10. DOI: 10.21055/0370-1069-2016-2-107-110.

6. Саяпина Л.В., Хорева И.И., Байдалова Н.П., Горяев А.А., Давыдов Д.С., Поступайло В.Б., Меркулов В.А. Оценка остаточной вирулентности вакцинного штамма Francisella tularensis 15 НИИЭГ по данным многолетних наблюдений. Проблемы особо опасных инфекций. 2018; (1):98–102. DOI: 10.21055/0370-1069-2018-1-98-102.

7. Нарышкина Е.А., Краснов Я.М., Альхова Ж.В., Баданин Д.В., Осин А.В., Ляшова О.Ю., Саяпина Л.В., Бондарев В.П., Меркулов В.А., Олефир Ю.В., Кутырев В.В. Полногеномное секвенирование и филогенетический анализ вакцинного штамма Francisella tularensis 15 НИИЭГ. Проблемы особо опасных инфекций. 2020; (2):91–7. DOI: 10.21055/0370-1069-2020-2-91-97.

8. Svensson K., Larsson P., Johansson D., Byström M., Forsman M., Johansson A. Evolution of subspecies of Francisella tularensis. J. Bacteriol. 2005; 187(11):3903–8. DOI: 10.1128/JB.187.11.3903-3908.2005.

9. Jaing C.J., McLoughlin K.S., Thissen J.B., Zemla A., Gardner S.N., Vergez L.M., Bourguet F., Mabery S., Fofanov V.Y., Koshinsky H., Jackson P.J. Identification of genome-wide mutations in ciprofloxacin-resistant F. tularensis LVS using whole genome tiling arrays and next generation sequencing. PLoS One. 2016; 11(9):e0163458. DOI: 10.1371/journal.pone.0163458.

10. Samrakandi M.M., Zhang C., Zhang M., Nietfeldt J., Kim J., Iwen P.C., Olson M.E., Fey P.D., Duhamel G.E., Hinrichs S.H., Cirillo J.D., Benson A.K. Genome diversity among regional populations of Francisella tularensis subspecies tularensis and Francisella tularensis subspecies holarctica isolated from the US. FEMS Microbiol Lett. 2004; 237(1):9–17. DOI: 10.1016/j.femsle.2004.06.008.

11. Larsson P., Svensson K., Karlsson L., Guala D., Granberg M., Forsman M., Johanssont A. Canonical insertion-deletion markers for rapid DNA typing of Francisella tularensis. Emerg. Infect. Dis. 2007; 13(11):1725–32. DOI: 10.3201/eid1311.070603.

12. Vogler A.J., Birdsell D., Price L.B., Bowers J.R., Beckstrom-Sternberg S.M., Auerbach R.K., Beckstrom-Sternberg J.S., Johansson A., Clare A., Buchhagen J.L., Petersen J.M., Pearson T., Vaissaire J., Dempsey M.P., Foxall P., Engelthaler D.M., Wagner D.M., Keim P. Phylogeography of Francisella tularensis: global expansion of a highly fit clone. J. Bacteriol. 2009; 191(8): 2474–84. DOI: 10.1128/JB.01786-08.

13. Karlsson E., Svensson K., Lindgren P., Byström M., Sjödin A., Forsman M., Johansson A. The phylogeographic pattern of Francisella tularensis in Sweden indicates a Scandinavian origin of Eurosiberian tularaemia. Environ. Microbiol. 2013; 15(2):634–45. DOI: 10.1111/1462-2920.12052.

14. Svensson K., Larsson P., Johansson D., Byström M., Forsman M., Johansson A. Evolution of subspecies of Francisella tularensis. J. Bacteriol. 2005; 187(11):3903–8. DOI: 10.1128/JB.187.11.3903-3908.2005.

15. Wick R.R., Judd L.M., Gorrie C.L., Holt K.E. Unicycler: Resolving bacterial genome assemblies from short and long sequencing reads. PLoS Comput. Biol. 2017; 13(6):e1005595. DOI: 10.1371/journal.pcbi.1005595.

16. Player R.A., Verratti K.J., Grady S.L., Beck L.C., Goodwin B.G., Earnhart C.G., Sozhamannan S. Complete genome sequence of Francisella tularensis live vaccine strain NR-28537 (BEI Master Cell Bank). Microbiol. Resour. Announc. 2020; 9(50):e01248-20. DOI: 10.1128/MRA.01248-20.

17. Shevtsov V., Kairzhanova A., Shevtsov A., Shustov A., Kalendar R., Abdrakhmanov S., Lukhnova L., Izbanova U., Ramankulov Y., Vergnaud G. Genetic diversity of Francisella tularensis subsp. holarctica in Kazakhstan. PLoS Negl. Trop. Dis. 2021; 15(5):e0009419. DOI: 10.1371/journal.pntd.0009419.

18. Rohmer L., Brittnacher M., Svensson K., Buckley D., Haugen E., Zhou Y., Chang J., Levy R., Hayden H., Forsman M., Olson M., Johansson A., Kaul R., Miller S.I. Potential source of Francisella tularensis live vaccine strain attenuation determined by genome comparison. Infect. Immun. 2006; 74(12):6895–906. DOI: 10.1128/IAI.01006-06.

19. Crawford R.M., Van De Verg L., Yuan L., Hadfield T.L., Warren R.L., Drazek E.S., Houng H.H., Hammack C., Sasala K., Polsinelli T.,. Thompson J., Hoover D.L. Deletion of purE attenuates Brucella melitensis infection in mice. Infect. Immun. 1996; 64(6):2188–92. DOI: 10.1128/iai.64.6.2188-2192.1996.

20. Karlsson J., Prior R.G., Williams K., Lindler L., Brown K.A., Chatwell N., Hjalmarsson K., Loman N., Mack K.A., Pallen M., Popek M., Sandström G., Sjöstedt A., Svensson T., Tamas I., Andersson S.G., Wren B.W., Oyston P.C., Titball R.W. Sequencing of the Francisella tularensis strain Schu 4 genome reveals the shikimate and purine metabolic pathways, targets for the construction of a rationally attenuated auxotrophic vaccine. Microb. Comp. Genomics. 2000; 5(1):25–39. DOI: 10.1089/10906590050145249.

21. Ivánovics G., Marjai E., Dobozy A. The growth of purine mutants of Bacillus anthracis in the body of the mouse. J. Gen. Microbiol. 1968; 53(2):147–62. DOI: 10.1099/00221287-53-2-147.

22. O’Callaghan D., Maskell D., Tite J., Dougan G. Immune responses in BALB/c mice following immunization with aromatic compound or purine-dependent Salmonella typhimurium strains. Immunology. 1990; 69(2):184–9.

23. DeAngelis P.L. Evolution of glycosaminoglycans and their glycosyltransferases: Implications for the extracellular matrices of animals and the capsules of pathogenic bacteria. Anat. Rec. 2002; 268(3):317–26. DOI: 10.1002/ar.10163.

24. Kahler C.M., Carlson R.W., Rahman M.M., Martin L.E., Stephens D.S. Two glycosyltransferase genes, lgtF and rfaK, constitute the lipooligosaccharide ice (inner core extension) biosynthesis operon of Neisseria meningitidis. J. Bacteriol. 1996; 178(23):6677– 84. DOI: 10.1128/jb.178.23.6677-6684.1996.

25. Phillips N.J., Schilling B., McLendon M.K., Apicella M.A., Gibson B.W. Novel modification of lipid A of Francisella tularensis. Infect. Immun. 2004; 72(9):5340–8. DOI: 10.1128/IAI.72.9.5340-5348.2004.

26. Павлов В.М., Дятлов И.А. Молекулярно-генетические исследования бактерий рода Francisella и их прикладное значение. М.; 2012. 267 с.

27. Iyer R., Williams C., Miller C. Arginine-agmatine antiporter in extreme acid resistance in Escherichia coli. J. Bacteriol. 2003; 185(22):6556–61. DOI: 10.1128/jb. 185.22.6556-6561.2003.

28. Гайский Н.А. Туляремийная вирус-вакцина. 2-е изд. Иркутск: Иркутское обл. изд-во; 1948. 111 с.

29. Sandström G. The Tularaemia vaccine. J. Chem. Tech. Biotechnol. 1994; 59(4):315–20. DOI: 10.1002/jctb.2805.