Разработка способа детекции жизнеспособных холерных вибрионов путем определения нарастания титра специфического бактериофага с помощью ПЦР-РВ

Цель – разработка непрямого метода определения жизнеспособных холерных вибрионов путем оценки нарастания титра специфического бактериофага, детектируемого в ПЦР-РВ.
Материалы и методы. Для исследования взят холерный бактериофаг Rostov М3 (миовирус класса Caudoviricetes; GenBank: MN379460.1- MN379463.1). Изучение биологических свойств фага проводили общепринятыми методами с небольшими модификациями. Праймеры для амплификации фага сконструированы с помощью https://bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0. Культивирование проб, содержащих жизнеспособные и нежизнеспособные Vibrio cholerae, с бактериофагом осуществляли в 1 % пептонной воде в течение времени Т₀ и Т_n. Результат ПЦР выражали в числе фаговых частиц на 1 мл образца или величиной Ср.
Результаты и обсуждение. Бактериофаг Rostov М3 имеет высокую скорость адсорбции и урожайность, а также обладает широким спектром литической активности в отношении V. cholerae О1 Classical и El Tor. В процессе накопления частиц фага Rostov М3 фиксировали снижение величины Cp при инкубировании пробы не менее двух часов. В этом случае делается заключение о присутствии в пробе жизнеспособных холерных вибрионов. Используя данный метод, можно выявить бактериальные клетки, находящиеся в живом, но некультивируемом состоянии, так как фаги способны к размножению в клетках этого фенотипа. Применение метода на инактивированных культурах (негативный контроль) V. cholerae не показало нарастания количества частиц фага относительно нулевой точки, что позволяет сделать вывод об отсутствии в образце жизнеспособных клеток. Авторами предложен метод, который позволяет установить разницу в уровнях накопления фаговых частиц при исследовании проб, содержащих живые и неживые бактерии V. cholerae О1, в контакте с бактериофагом Rostov М3 в течение определенного времени Т₀ и Т_n. Разработанная методика позволяет расширить возможности косвенного обнаружения жизнеспособных V. cholerae О1 Classical и El Tor в зараженных объектах.

1. Nelson E.J., Harris J.B., Morris J.G. Jr, Calderwood S.B., Camilli A. Cholera transmission: the host, pathogen and bacteriophage dynamic. Nat. Rev. Microbiol. 2009; 7(10):693–702. DOI: 10.1038/nrmicro2204.

2. Santoriello F.J., Michel L., Unterweger D., Pukatzki S. Pandemic Vibrio cholerae shuts down site-specific recombination to retain an interbacterial defence mechanism. Nat. Commun. 2020; 11(1):6246. DOI: 10.1038/s41467-020-20012-7.

3. Weill F.X., Domman D., Njamkepo E., Tarr C., Rauzier J., Fawal N., Keddy K.H., Salje H., Moore S., Mukhopadhyay A.K., Bercion R., Luquero F.J., Ngandjio A., Dosso M., Monakhova E., Garin B., Bouchier C., Pazzani C., Mutreja A., Grunow R., Sidikou F., Bonte L., Breurec S., Damian M., Njanpop-Lafourcade B.M., Sapriel G., Page A.L., Hamze M., Henkens M., Chowdhury G., Mengel M., Koeck J.L., Fournier J.M., Dougan G., Grimont P.A.D., Parkhill J., Holt K.E., Piarroux R., Ramamurthy T., Quilici M.L., Thomson N.R. Genomic history of the seventh pandemic of cholera in Africa. Science. 2017; 358(6364):785–9. DOI: 10.1126/science. aad5901.

4. Domman D., Quilici M.L., Dorman M.J., Njamkepo E., Mutreja A., Mather A.E., Delgado G., Morales-Espinosa R., Grimont P.A.D., Lizárraga-Partida M.L., Bouchier C., Aanensen D.M., KuriMorales P., Tarr C.L., Dougan G., Parkhill J., Campos J., Cravioto A., Weill F.X., Thomson N.R. Integrated view of Vibrio cholerae in the Americas. Science. 2017; 358(6364):789–93. DOI: 10.1126/science.aao2136.

5. Bogosian G., Bourneuf E.V. A matter of bacterial life and death. EMBO Rep. 2001; 2(9):770–4. DOI: 10.1093/embo-reports/kve182.

6. Oliver J.D. Recent findings on the viable but nonculturable state in pathogenic bacteria. FEMS Microbiol. Rev. 2010; 34(4):415– 25. DOI: 10.1111/j.1574-6976.2009.00200.x.

7. Colwell R.R., Brayton P.R., Grimes D.J., Roszak D.B., Huq S.A., Palmer L.M. Viable but non-culturable Vibrio cholerae and related pathogens in the environment: implications for release of genetically engineered microorganisms. Nature Biotech. 1985; 3(9):817–20. DOI: 10.1038/nbt0985-817.

8. Габрилович И.М., редактор. Практическое пособие по бактериофагии. Минск: Вышэйш. школа; 1968. 179 с.

9. Kropinski A.M., Mazzocco A., Waddell T.E., Lingohr E., Johnson R.P. Enumeration of bacteriophages by double agar overlay plaque assay. Methods Mol. Biol. 2009; 501:69–76. DOI: 10.1007/978-1-60327-164-6_7.

10. Maina A.N., Mwaura F.B., Wagacha J.M., Jumba M., Aziz R.K., Nour El-Din H.T. Phenotypic characterization of phage vB_vcM_Kuja. J. Basic Microbiol. 2023; 63(5):481–8. DOI: 10.1002/jobm.202200635.

11. Untergasser A., Cutcutache I., Koressaar T., Ye J., Faircloth B.C., Remm M., Rozen S.G. Primer3 – new capabilities and interfaces. Nucleic Acids Res. 2012; 40(15):e115. DOI: 10.1093/nar/gks596.

12. Koressaar T., Remm M. Enhancements and modifications of primer design program Primer3. Bioinformatics. 2007; 23(10):1289–91. DOI: 10.1093/bioinformatics/btm091.

13. Ben Said M., Masahiro O., Hassen A. Detection of viable but non cultivable Escherichia coli after UV irradiation using a lytic Qbeta phage. Ann. Microbiol. 2010; 60(1):121–7. DOI: 10.1007/s13213-010-0017-4.

14. Fernandes E., Martins V.C., Nóbrega C., Carvalho C.M., Cardoso F.A., Cardoso S., Dias J., Deng D., Kluskens L.D., Freitas P.P., Azeredo J. A bacteriophage detection tool for viability assessment of Salmonella cells. Biosens. Bioelectron. 2014; 52:239–46. DOI: 10.1016/j.bios.2013.08.053.