Оптимизация метода мультилокусного сиквенс-типирования генов вирулентности (MVLST) Bacillus anthracis

В России эпидемическая ситуация по сибирской язве остается нестабильной, несмотря на достигнутые успехи в профилактике и лечении. Независимо от характера вспышки, эпидемиологическое расследование требует установления вероятного происхождения и генетического родства штамма, ее вызвавшего, что достигается при молекулярном типировании. Bacillus anthracis отличается высокой генетической мономорфностью, усложняющей молекулярное типирование. Вариант MLST, метод мультилокусного сиквенс-типирования генов вирулентности (MVLST) позволяет эффективно дифференцировать штаммы возбудителя. Цель работы – выбор оптимальной схемы MVLST для генетического типирования B. anthracis. Материалы и методы. Использовали полные геномы 49 штаммов B. anthracis. Для построения филограмм с алгоритмом UPGMA выявляли SNP в программе PhyloViz. Вирулентность белков оценивали и отбор кодируемых генов проводили с онлайн-ресурсом «VirulentPred: Prediction of prokariotic virulent protein». Определение индекса дискриминации D Хантера – Гастона проводили онлайн в программе Discriminatory Power Calculator. Результаты и обсуждение. MVLST-pXO1 включала пять генов: lef, cya, pagA, atxA, gerXC, – локализованных на плазмиде токсинообразования pXO1. Типирование по схеме MVLSTpXO1 49 штаммов позволило разделить их на 21 генотип (D=0,9209). Схема MVLST-pXO2 охватывала четыре структурных гена капсульного полипептида: capA, capB, capC, capD – и два регуляторных гена: acpA, acpB – плазмиды капсулообразования pXO2. Типирование по схеме MVLST-pXO2 разделило 49 штаммов на 14 генотипов (D=0,6675). Полученная схема MVLST-15 по сравнению с MVLST-19 обеспечивала более высокую дискриминирующую силу, так как разделяла 49 штаммов B. anthracis на 40 генотипов (D=0,9864), тогда как показатели MVLST-19 составляли соответственно 33 генотипа (D=0,9633). Результаты показывают, что оптимальной может быть схема MVLST-15, так как обеспечивает лучшую дискриминацию штаммов B. anthracis, используя меньший набор локусов при сохранении классической филогенетической структуры возбудителя сибирской язвы.

1. Рязанова А.Г., Еременко Е.И., Аксенова Л.Ю., Семенова О.В., Буравцева Н.П., Головинская Т.М., Куличенко А.Н. Оценка эпидемиологической и эпизоотологической обстановки по сибирской язве в 2016 г., прогноз на 2017 г. Проблемы особо опасных инфекций. 2017; (1):21–3. DOI: 10.21055/0370-1069-2017-1-21-23.

2. Rasko D.A., Worsham P.L., Abshire T.G., Stanley S.T., Bannan J.D., Wilson M.R., Langham R.J., Decker R.S. Jiang L., Read T.D., Phillippy A.M., Salzberg S.L., Pop M., Van Ert M.N., Kenefic L.J., Keim P.S., Fraser-Liggett C.M., Ravel J. Bacillus anthracis comparative genome analysis in support of the Amerithrax investigation. Proc. Natl Acad. Sci. USA. 2011; 108(12):5027–32. DOI: 10.1073/pnas.1016657108.

3. Van Ert M.N., Easterday W.R., Huynh L.Y., Okinaka R.T., Hugh-Jones M.E., Ravel J., Zanecki S.R., Pearson T., Simonson T.S., U’Ren J.M., Kachur S.M., Leadem-Dougherty R.R., Rhoton S.D., Zinser G., Farlow J., Coker P.R., Smith K.L., Wang B., Kenefic L.J., Fraser-Liggett C.M., Wagner D.M., Keim P. Global genetic population structure of Bacillus anthracis. PLoS One. 2007; 2(5):e461. DOI: 10.1371/journal.pone.0000461.

4. Еременко Е.И., Печковский Г.А., Рязанова А.Г., Писаренко Н.В., Ковалев Д.А., Аксенова Л.Ю., Семенова О.В., Куличенко А.Н. Анализ in silico геномов штаммов Bacillus anthracis главных генетических линий. Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. 2023; 100(3):155–65. DOI: 10.36233/0372-9311-385.

5. Pilo P., Frey J. Pathogenicity, population genetics and dissemination of Bacillus anthracis. Infect. Genet. Evol. 2018; 64:115–25. DOI: 10.1016/j.meegid.2018.06.024.

6. Sirard J.C., Guidi-Rontani C., Fouet A., Mock M. Characterization of a plasmid region involved in Bacillus anthracis toxin production and pathogenesis. Int. J. Med. Microbiol. 2000; 290(4-5):313–6. DOI: 10.1016/S1438-4221(00)80030-2.

7. Heffernan B.J., Thomason B., Herring-Palmer A., Shaughnessy L., McDonald R., Fisher N., Huffnagle G.B., Hanna P. Bacillus anthracis phospholipases C facilitate macrophage-associated growth and contribute to virulence in a murine model of inhalation anthrax. Infect. Immun. 2006; 74(7):3756–64. DOI: 10.1128/IAI.00307-06.

8. Shatalin K., Gusarov I., Avetissova E., Shatalina Y., McQuade L.E., Lippard S.J., Nudler E. Bacillus anthracis-derived nitric oxide is essential for pathogen virulence and survival in macrophages. Proc. Natl Acad. Sci. USA. 2008; 105(3):1009–13. DOI: 10.1073/pnas.0710950105.

9. Samant S., Hsu F.-F., Neyfakh A.A., Lee H. The Bacillus anthracis protein MprF is required for synthesis of lysylphosphatidylglycerols and for resistance to cationic antimicrobial peptides. J. Bacteriol. 2009; 191(4):1311–9. DOI: 10.1128/JB.01345-08.

10. Lepore L.S., Roelvink P.R., Granados R.R. Enhancin, the granulosis virus protein that facilitates nucleopolyhedrovirus (NPV) infections, is a metalloprotease. J. Invertebr. Pathol. 1996; 68(2):131–40. DOI: 10.1006/jipa.1996.0070.

11. Read T.D., Peterson S.N., Tourasse N., Baillie L.W., Paulsen I.T., Nelson K.E., Tettelin H., Fouts D.E., Eisen J.A., Gill S.R., Holtzapple E.K., Okstad O.A., Helgason E., Rilstone J., Wu M., Kolonay J.F., Beanan M.J., Dodson R.J., Brinkac L.M., Gwinn M., DeBoy R.T., Madpu R., Daugherty S.C., Durkin A.S., Haft D.H., Nelson W.C., Peterson J.D., Pop M., Khouri H.M., Radune D., Benton J.L., Mahamoud Y., Jiang L., Hance I.R., Weidman J.F., Berry K.J., Plaut R.D., Wolf A.M., Watkins K.L., Nierman W.C., Hazen A., Cline R., Redmond C., Thwaite J.E., White O., Salzberg S.L., Thomason B., Friedlander A.M., Koehler T.M., Hanna P.C., Kolstø A.-B., Fraser C.M. The genome sequence of Bacillus anthracis Ames and comparison to closely related bacteria. Nature. 2003; 423(6935):81–6. DOI: 10.1038/nature01586.

12. Jones M.B., Blaser M.J. Detection of a luxS-signaling molecule in Bacillus anthracis. Infect. Immun. 2003; 71(7):3914–9. DOI: 10.1128/IAI.71.7.3914-3919.2003.

13. Shannon J.G., Ross C.L., Koehler T.M., Rest R.F. Characterization of Anthrolysin O, the Bacillus anthracis cholesterol-dependent cytolysin. Infect. Immun. 2003; 71(6):3183–9. DOI: 10.1128/IAI.71.6.3183-3189.2003.

14. Tran S.-L., Guillemet E., Gohar M., Lereclus D., Ramarao N. CwpFM (EntFM) is a Bacillus cereus potential cell wall peptidase implicated in adhesion, biofilm formation, and virulence. J. Bacteriol. 2010; 192(10):2638–42. DOI: 10.1128/JB.01315-09.

15. Xie G., Keyhani N.O., Bonner C.A., Jensen R.A. Ancient origin of the tryptophan operon and the dynamics of evolutionary change. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 2003; 67(3):303–42. DOI: 10.1128/MBR.67.3.303-342.2003.

16. Еременко Е.И. Система приобретения связанного с гемом железа у Вacillus аnthracis. Молекулярная генетика, микробиология и вирусология. 2017; 35(1):3–7. DOI 10.18821/0208-0613-2017-35-1-3-7.

17. Куличенко А.Н., Еременко Е.И., Рязанова А.Г., Аксенова Л.Ю., Ковалев Д.А., Писаренко С.В., Варфоломеева Н.Г., Жиров А.М., Волынкина А.С., Буравцева Н.П., Головинская Т.М., Котенева Е.А., Цыганкова О.И., Дятлов И.А., Тимофеев В.С., Богун А.Г., Бахтеева И.В., Кисличкина А.А., Миронова Р.И., Титарева Г.М., Скрябин Ю.П., Селянинов Ю.О., Егорова И.Ю., Колбасов Д.В. Биологические свойства и молекулярно-генетическая характеристика штаммов Bacillus anthracis, выделенных во время вспышки сибирской язвы в Ямало-Ненецком автономном округе в 2016 г. Проблемы особо опасных инфекций. 2017; (1):94–9. DOI: 10.21055/0370-1069-2017-1-94-99.

18. Гончарова Ю.О., Богун А.Г., Бахтеева И.В., Титарева Г.М., Миронова Р.И., Кравченко Т.Б., Остарков Н.А., Брушков А.В., Тимофеев В.С., Игнатов С.Г. Аллельный полиморфизм генов факторов патогенности возбудителя сибирской язвы как метод оценки микробиологических рисков при изменении климата. Прикладная биохимия и микробиология. 2022; 58(4):338–51. DOI: 10.31857/S0555109922040055.

19. Гончарова Ю.О., Хлопова К.В., Евсеева В.В., Кравченко Т.Б., Миронова Р.И., Бахтеева И.В., Соломенцев В.И., Скрябин Ю.П., Тимофеев В.С. MVLST-анализ штаммов Bacillus anthracis эволюционной линии B. Молекулярная генетика, микробиология и вирусология. 2024; 42(3):12–21. DOI: 10.17116/molgen20244203112.

20. Гончарова Ю.О., Бахтеева И.В., Миронова Р.И., Богун А.Г., Хлопова К.В., Тимофеев В.С. Мультилокусное сиквенстипирование штаммов сибиреязвенного микроба, выделенных на территории России и сопредельных государств. Проблемы особо опасных инфекций. 2021; (1):95–102. DOI: 10.21055/03701069-2021-1-95-102.

21. Garg A., Gupta D. VirulentPred: a SVM based prediction method for virulent proteins in bacterial pathogens. BMC Bioinformatics. 2008; 9:62. DOI: 10.1186/1471-2105-9-62.

22. Hunter P.R. Reproducibility and indices of discriminatory power of microbial typing methods. J. Clin. Microbiol. 1990; 28(9):1903–5. DOI: 10.1128/jcm.28.9.1903-1905.1990.