Создание и свойства штамма Francisella tularensis 15 НИИЭГ без гена sodC

Цель исследования – создание и изучение иммуногенных свойств штамма Francisella tularensis 15 НИИЭГ без гена sodC, кодирующего CuZn-зависимую супероксиддисмутазу. Материалы и методы. Делецию гена sodC из хромосомы туляремийного микроба проводили методом аллельного обмена с использованием суицидного плазмидного вектора pGM5. Модифицированный фрагмент хромосомы без структурной части гена sodC создавали объединением ампликонов, синтезированных методом ПЦР с помощью двух пар праймеров. Для переноса плазмид в бактерии Escherichia coli и F. tularensis использовали метод электропорации. Для иммунизации и заражения использовали мышей линии BALB/c. Для оценки реактогенности штаммов для мышей определяли средний вес животных в группах. Результаты и обсуждение. Методом аллельного обмена создан штамм F.  tularensis 15ΔsodC, в хромосоме которого отсутствовал фрагмент размером 545 п.о. со структурной частью гена sodC. Данный штамм не отличался по вирулентности и реактогенности от исходного штамма 15 НИИЭГ, но мыши, иммунизированные делетированным вариантом вакцинного штамма, легче переносили экспериментальную инфекцию, вызванную природным штаммом F. tularensis subsp. mediasiatica А-678. Сделано предположение, что удаление гена sodC может улучшить иммуногенные свойства штамма туляремийного микроба при целенаправленном конструировании перспективного кандидата для создания современной туляремийной вакцины со сниженной реактогенностью.

1. Олсуфьев Н.Г. Таксономия, микробиология и лабораторная диагностика возбудителя туляремии. М.: Медицина; 1975. 192 с.

2. Соколов М.И., редактор. Профилактика инфекций живыми вакцинами. М.: Медгиз; 1960. С. 356.

3. Медуницын Н.В. Вакцинология. 3-е изд., перераб. и доп. М.: Триада-Х; 2010. 512 с.

4. Larsson P., Oyston P.C.F., Chain P., Chu M.C., Duffield M., Fuxelius H.-H., Garcia E., Hälltorp G., Johansson D., Isherwood K.E., Karp P.D., Larsson E., Liu Y., Michell S., Prior J., Prior R., Malfatti S., Sjöstedt A., Svensson K., Thompson N., Vergez L., Wagg J.K., Wren B.W., Lindler L.E., Andersson S.G.E., Forsman M., Titball R.W. The complete genome sequence of Francisella tularensis, the causative agent of tularemia. Nat. Genet. 2005; 37(2):153–9. DOI: 10.1038/ng1499.

5. Melillo A.A., Mahawar M., Sellati T.J., Malik M., Metzger D.W., Melendez J.A., Bakshi C.S. Identification of Francisella tularensis live vaccine strain CuZn superoxide dismutase as critical for resistance to extracellularly generated reactive oxygen species. J. Bacteriol. 2009; 191(20):6447–56. DOI: 10.1128/JB.00534-09.

6. Мокриевич А.Н., Тимофеев В.С., Кудрявцева Т.Ю., Уланова Г.И., Карбышева С.Б., Миронова Р.И., Вахрамеева Г.М., Губарева Т.И., Павлов В.М., Дятлов И.А. Выделение среднеазиатского подвида туляремийного микроба на территории Алтайского края. Проблемы особо опасных инфекций. 2013; (1):66–9. DOI: 10.21055/0370-1069-2013-1-66-69.

7. Woodcock D.M., Crowther P.J., Doherty J., Jefferson S., DeCruz E., Noyer-Weidner M., Smith S.S., Michael M.Z., Graham M.W. Quantitative evaluation of Escherichia coli host strains for tolerance to cytosine methylation in plasmid and phage recombinants. Nucleic Acids Res. 1989; 17(9):3469–78. DOI: 10.1093/nar/17.9.3469.

8. Мокриевич А.Н., Вахрамеева Г.М., Титарева Г.М., Бахтеева И.В., Миронова Р.И., Комбарова Т.И., Кравченко Т.Б., Дятлов И.А., Павлов В.М. Получение и свойства вакцинного штамма туляремийного микроба без одной копии гена iglC и без гена recA. Молекулярная генетика, микробиология и вирусология. 2015; (3):33–9.

9. Миллер Д. Эксперименты в молекулярной генетике. М.: Мир; 1976. 440 с.

10. Лапин А.А., Павлов В.М., Мокриевич А.Н., Домотенко Л.В., Храмов М.В. Простая жидкая питательная среда для молекулярно-генетических исследований Francisella tularensis. Проблемы особо опасных инфекций. 2009; (4):66–7. DOI: 10.21055/0370-1069-2009-4(102)-66-67.

11. Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Дж. Методы генетической инженерии. Молекулярное клонирование. М.: Мир; 1984. 480 с.

12. Шишкова Н.А., Вахрамеева Г.М., Павлов В.М., Мокриевич А.Н., Дятлов И.А. Плазмидная криотрансформация вакцинного штамма Francisella tularensis 15 линии НИИЭГ. Бактериология. 2018; 3(2):38–42. DOI: 10.20953/2307-6631-2018-2-38-42.

13. Lessard J.C. Transformation of E. coli via electroporation. Methods Enzymol. 2013; 529:321–7. DOI: 10.1016/B978-0-12-418687-3.00027-6.

14. National Research Council of the National Academies. Guide for the Care and Use of Laboratory Animals. 8th ed. Washington (D.C.): National Academy Press; 2011. 220 p. DOI: 10.17226/12910.

15. Ашмарин И.П., Воробьев А.А. Статистические методы в микробиологических исследованиях. Л.: Медгиз; 1962. С. 85–104.

16. Bakshi C.S., Malik M., Regan K., Melendez J.A., Metzger D.W., Pavlov V.M., Sellati T.J. Superoxide dismutase B gene (sodB)deficient mutants of Francisella tularensis demonstrate hypersensitivity to oxidative stress and attenuated virulence. J. Bacteriol. 2006; 188(17):6443–8. DOI: 10.1128/JB.00266-06.