Применение 2D-электрофореза для получения «белковых портретов» лизатов бактериальных культур возбудителей особо опасных инфекций

Цель работы: применение 2D-электрофореза для получения «белковых портретов» лизатов бактериальных культур возбудителей особо опасных инфекций. Материалы и методы. «Белковые портреты» получали на модели нетоксигенного штамма V. choleraе биовара Эль Тор М-888 и штамма Y. pestis EV НИИЭГ, выращенного при 28 и 37 °С. В качестве препарата сравнения использовали коммерческий образец лизата штамма E. coli . SDS-PAGE-электрофорез проводили классическим методом Lаemmli, в основу постановки 2D-электрофореза положены метод O’Farrel и рекомендации производителя. Для визуализации белков электрофореграммы окрашивали Кумасси синим G-250 или нитратом серебра. Концентрацию белка измеряли методом Бредфорда. Образцы клеточных лизатов очищали от небелковых примесей с помощью набора ReadyPrep 2-D Cleanup Kit. Результаты и выводы. Описан высокоэффективный комплексный метод разделения смеси белков, включающий этап приготовления образцов бактериальных культур в результате разрушения клеток ультразвуком в лизирующем буфере, их очистку и дальнейший анализ в одном направлении по заряду в градиенте pH, в другом направлении - по молекулярной массе методом SDS-PAGE-электрофореза. После окрашивания 2D-гели анализировали с помощью программного обеспечения Dymension мультифункциональной системы гель-документирования Syngene. Использование для ИЭФ стрипов с иммобилизованным градиентом рН заданного диапазона, коммерческих наборов реактивов и полиакриламидных гелей больших размеров позволило оптимизировать условия проведения 2D-электрофореза, сократить время, увеличить точность и воспроизводимость анализа. На модели лизатов нетоксигенного штамма V. choleraе биовара Эль Тор М-888 и штамма Y. pestis EV, выращенного при 28 и 37 °С, с помощью 2D-электрофореза получены «белковые портреты» изучаемых штаммов, показана высокая эффективность метода и возможность его использования для изучения динамики экспрессии генов возбудителей особо опасных инфекций.

2D-электрофорез, Vibrio cholerae, Yersinia pestis, 2D-electrophoresis

1. Остерман Л.А. Методы исследования белков и нуклеиновых кислот: Электрофорез и ультрацентрифугирование. М.: Наука; 1981. 288 с.

2. Bradford M.M. Rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal. Biochem. 1976; 72:248-54.

3. Chromy B.A., Choi M.W., Murphy G.A., Gonzales A.D., Corzett C.H., Chang B.C., Fitch J.P., McCutchen-Maloney S.L. Proteomic characterization of Yersinia pestis virulence. J. Bacteriol. 2005; 187(23):8172-80. DOI: 10.1128/JB.187.23.8172-8180.2005.

4. Coelho A., Santos E.O., Faria M.L., Carvalho D.P., Soares M.R., Kruger W.M., Bisch P.M. A proteome reference map for Vibrio cholerae El Tor. Proteomics. 2004; 4:1491-504. DOI: 10.1002/pmic.200300685.

5. Laemmli W.K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T 4. Nature. 1970; 227(5259):680-5. DOI: 10.1038/227680a0.

6. O'Farrell P. H. High resolution two-dimensional electrophoresis of proteins. J. Biol. Chem. 1975; 250(10):4007-21.

7. Swain M., Ross N.W. A silver stain protocol for proteins yielding high resolution and transparent background in sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gels. Electrophoresis. 1995; 16:948-51. DOI: 10.1002/elps.11501601159.