Иммуночипы для одновременного обнаружения пяти ботулотоксинов методом фосфоресцентного анализа (ФОСФАН)

Цель работы. Разработать и сравнить по чувствительности тесты для одновременного обнаружения ботулотоксинов A, B, C, E, F методом мультиплексного фосфоресцентного анализа (ФОСФАН) с применением стандартной (на основе Pt копропорфирина) и модифицированной (на основе биоспецифичных наночастиц) систем регистрации фосфоресцентного сигнала. Материалы и методы. Иммуноанализ по технологии ФОСФАН выполняли в лунках стандартного 96-луночного микропланшета. На дне каждой лунки были напечатаны в виде микропятен моноспецифические антитела и поливалентный иммуноглобулин. Диапазон анализируемых концентраций анатоксинов – от 100 до 0,005 нг/мл. Для проявления реакции использовали смесь конъюгированных с биотином моноспецифических и поливалентного иммуноглобулинов и детекторные системы на основе конъюгатов стрептавидина с Pt копропорфирином или полистироловыми наночастицами, содержащими хелат европия. Люминесценцию обоих метчиков регистрировали на биочип-анализаторе в режиме временного разрешения. Порог детекции определяли как минимальную концентрацию анатоксина, при которой отношение P/N ≥ 2, а число таких проб (в серии из 10–30 экспериментов) не менее 50 %. Результаты и выводы. Разработанные иммуночипы обеспечивали группоспецифическое обнаружение пяти ботулотоксинов с возможностью типоспеци- фической идентификации ботулотоксинов А, В и Е. Перекрестные реакции между ботулотоксинами не выявлены. Применение фосфоресцентных наночастиц позволило повысить чувствительность детекции примерно на порядок до 10 пг/мл. Разработанные мультиплексные тесты можно рекомендовать для специфической индикации ботулотоксинов в клинических образцах, пробах из объектов окружающей среды или пищевых продуктов. 

1. Осин Н.С., Помелова В.Г., Соколов А.С., Быченкова Т.А., Бекман Н.И., Шарафудинова Т.Ю., Аслиян С.К., Ивановская Н.П., Ларичева С.Ю., Канаева Т.А. Фосфоресцентный микроанализ как новая технологическая платформа для молекулярной диагностики. Вестник РАМН. 2007; 12:3–10.

2. Помелова В.Г., Быченкова Т.А., Осин Н.С. Иммуночип на основе микропланшетной технологии ФОСФАН для определе- ния иммуноглобулинов G к вирусам Западного Нила, Крымской- Конго геморрагической лихорадки и клещевого энцефалита. Пробл. особо опасных инф. 2009; 3(101):54–8.

3. Arnon S.S., Schechter R., Inglesby T.V., Henderson D.A., Bartlett J.G., Ascher M.S., Eitzen E., Fine A.D. Hauer J., Layton M., Lillibridge S., Osterholm M.T., O'Toole T., Parker G., Perl T.M., Russell P.K., Swerdlow D.L., Tonat K.; Working Group on Civilian Biodefense. Botulinum toxin as a biological weapon: medical and public health management. JAMA. 2001; 285(8):059–70.

4. Capek P., Dickerson T.J. Sensing the Deadliest Toxin: Technologies for Botulinum Neurotoxin Detection. Toxins. 2010; 2:24–53; DOI: 10.3390/toxins2010024.

5. Doellgast G. J., Triscott M. X., Beard G. A., Bottoms J. D., Cheng T., Roh B. H., Roman M. G., Hall P. A., Brown Е. Sensitive enzyme-linked immunosorbent assay for detection of Clostridium botulinum neurotoxins A, B, and E using signal amplification via enzyme-linked coagulation assay. J. Clin. Microbiol. 1993; 31:2402–9.

6. Ferreira J. L., Eliasberg S. J., Edmonds P., Harrison M. A. Comparison of the mouse bioassay and enzyme-linked immunosor- bent assay procedures for the detection of type A botulinal toxin in food. J. Food Prot. 2004; 67(1):203–6.

7. Jaras K., Tajudin A.A., Ressine A., Soukka T., Marko-Varga G., Bjartell A., Malm J., Laurell T., Lilja H. Europium nanoparticles for signal enhancement of antibody microarrays on nanoporous sili- con. J. Proteome Res. 2008; 7:1308–14; DOI: 10.1021/pr700591j.

8. Jenko K.L., Zhang Y., Kostenko Y., Fan Y., Garcia-Rodriguez C., Lou J., Marks J.D., Varnum S.M. Development of an ELISA mi- croarray assay for the sensitive and simultaneous detection of ten biodefense toxins. Analyst. 2014; 139:5093–102; DOI: 10.1039/ c4an01270d.

9. Osin N.S., Pomelova V.G. Microarray immunophospho- rescence technology for the detection of infectious pathogens. In: National Institute of Allergy and Infectious Diseases, NIH. Frontiers in Research. Humana Press; 2008. P. 233–40. DOI: 10.1007/978-1- 59745-569-5_25.

10. Scarlatos A., Welt B. A., Cooper B.Y., Archer D., DeMarse T., Chau K.V. Methods for detecting botulinum toxin with appli- cability to screening foods against biological terrorist attacks. J. of Food Science. 2005; 70(8):121–30; DOI: 10.1111/j.1365-2621.2005. tb11525.x.

11. Schiavo G., Matteoli M., Montecucco C. Neurotoxins affecting neuroexocytosis. Physiol. Rev. 2000; 80:717–66.

12. Sharma S.K., Ferreira J.L., Eblen B.S., Whiting R.C. Detection of type A, B, E, and F Clostridium botulinum neurotoxins in foods by using an amplified enzyme-linked immunosorbent assay with digoxigenin-labeled antibodies. Appl. Environ. Microbiol. 2006; 72(2):1231–8. DOI: 10.1128/AEM.72.2.1231-1238.2006.

13. Wictome M. W., Newton K., Jameson K., Hallis B., Dunnigan P., Mackay E., Clarke S., Taylor R., Gaze J., Foster K., Shone C. C. Development of an in vitro bioassay for Clostridium botulinum type B neurotoxin in foods that is more sensitive than the mouse bioassay. Appl. Environ. Microbiol. 1999; 65(9):3787–92.