РАЗРАБОТКА АЛГОРИТМА ОПРЕДЕЛЕНИЯ УРОВНЯ ЭКСПРЕССИИ ГЕНОВ CTXA И TOXR VIBRIO CHOLERAE МЕТОДОМ ОТ-ПЦР С ГИБРИДИЗАЦИОННО-ФЛУОРЕСЦЕНТНЫМ УЧЕТОМ РЕЗУЛЬТАТОВ В РЕЖИМЕ РЕАЛЬНОГО ВРЕМЕНИ
https://doi.org/10.21055/0370-1069-2017-3-53-57
Аннотация
Цель. Создание алгоритма оценки экспрессии структурных и регуляторных генов вирулентности Vibrio cholerae на модели генов ctxA и toxR, кодирующих и контролирующих биосинтез холерного токсина.
Материалы и методы. В работе использовано 10 штаммов Vibrio choleraе классического и Эль Тор биоваров. Клонирование фрагментов генов проводили путем лигирования и трансформации. ОТ-ПЦР проводили на амплификаторах «БИС М112» и «Rotor-GeneQ». Обработку результатов осуществляли с помощью программного обеспечения к прибору RotorGeneQ (Software 1.8.17.5).
Результаты и выводы. Разработан алгоритм оценки уровня экспрессии генов ctxА и toxR V. cholerae методом ОТ-ПЦР с гибридизационно-флуоресцентным учетом результатов в режиме реального времени. Указанный алгоритм позволяет быстро и эффективно проводить статистически значимое определение экспрессии структурных и регуляторных генов вирулентности V. cholerae и может быть использован для оценки вновь выделяемых штаммов холерного вибриона.
Об авторах
А. А. Крицкий
ФКУЗ «Российский научно-исследовательский противочумный институт «Микроб»
Россия
410005, Саратов, ул. Университетская, 46
Россия
410005, Саратов, ул. Университетская, 46
Н. Б. Челдышова
ФКУЗ «Российский научно-исследовательский противочумный институт «Микроб»
Россия
410005, Саратов, ул. Университетская, 46
Россия
410005, Саратов, ул. Университетская, 46
И. В. Тучков
ФКУЗ «Российский научно-исследовательский противочумный институт «Микроб»
Россия
410005, Саратов, ул. Университетская, 46
Россия
410005, Саратов, ул. Университетская, 46
Н. И. Смирнова
ФКУЗ «Российский научно-исследовательский противочумный институт «Микроб»
Россия
410005, Саратов, ул. Университетская, 46
Россия
410005, Саратов, ул. Университетская, 46
Список литературы
1. Смирнова Н.И., Челдышова Н.Б., Заднова С.П., Кутырев В.В. Молекулярно-генетические особенности штаммов Vibrio cholerae classica, вызвавших эпидемию азиатской холеры в России в 1942 г. Мол. генет., микробиол. и вирусол. 2001; 4:12–6.
2. Creating Standard Curves with genomic DNA or plasmid DNA templates for use in quantitative PCR. Applied Biosystems; 2003.
3. Livak K.J., Schmittgen T.D. Analysis of relative gene expression data using Real-Time quantitative PCR and the 2–ΔΔCt Method. Methods. 2001; 25(4):402–8. DOI: 10.1006/meth.2001.1262.
4. Malinen E., Kassinen A., Rinttila Т., Palva A. Comparison of real-time PCR with SYBR Green I or 5'-nuclease assays and dot-blot hybridization with rDNA-targeted oligonucleotide probes in quantification of selected faecal bacteria. Microbiology. 2003; 149(Pt 1):269–77. DOI: 10.1099/mic.0.25975-0.
5. Marashi S.M., Bakhshi B., Fooladi A.A., Tavakoli A., Sharifnia A., Pourshafie M.R. Quantitative expression of cholera toxin mRNA in Vibrio cholerae isolates with different CTX cassette arrangements. J. Med. Microbiol. 2012; 61(Pt 8):1071–3. DOI: 10.1099/jmm.0.038752-0.
6. Matson J.S., Withey J.H., DiRita V.J. Regulatory networks controlling Vibrio cholerae virulence gene expression. Infect. Immun. 2007; 75(12):554–29. DOI: 10.1128/IAI.01094-07.
7. Muller P.Y., Janovjak H., Miserez A.R., Dobbie Z. Processing of gene expression data generated by quantitative Real-Time RTPCR. Biotechniques. 2002; 32(6):1372–9.
8. Palmer S., Wiegand A.P., Maldarelli F., Bazmi H., Mican J.M., Polis М., Dewar R.L., Planta A., Liu S., Metcalf J.A., Mellors J.W., Coffin J.M. New real-time reverse transcriptase-initiated PCR assay with single-copy sensitivity for human immunodeficiency virus type 1 RNA in plasma. J. Clin. Microbiol. 2003; 41(10):4531–6.
9. Sharkey F.H., Banat I.M., Marchant R. Detection and quantification of gene expression in environmental bacteriology. Appl. Environ. Microbiol. 2004; 70(7):3795–806. DOI: 10.1128/AEM.70.7.3795–3806.2004.
10. Smith C.J., Osborn A.M. Advantages and limitations of quantitative PCR(Q-PCR)-based approaches in microbial ecology. FEMS Microbiol. Ecol. 2009; 67(1):6–20. DOI: 10.1111/j.15746941.2008.00629.x.
11. Wang Т., Brown M.J. mRNA quantification by real time TaqMan polymerase chain reaction: validation and comparison with RNase protection. Anal. Biochem. 1999; 269(1):198–201. DOI: 10.1006/abio.1999.4022.
12. Fykse E.M., Skogan G., Davies W., Olsen J.S., Blatny J.M. Detection of Vibrio cholerae by real-time nucleic acid sequence-based amplification. Appl. Environ. Microbiol. 2007; 73(5):1457–66. DOI: 10.1128/AEM.01635-06.
Рецензия
Для цитирования:
Крицкий А.А., Челдышова Н.Б., Тучков И.В., Смирнова Н.И. РАЗРАБОТКА АЛГОРИТМА ОПРЕДЕЛЕНИЯ УРОВНЯ ЭКСПРЕССИИ ГЕНОВ CTXA И TOXR VIBRIO CHOLERAE МЕТОДОМ ОТ-ПЦР С ГИБРИДИЗАЦИОННО-ФЛУОРЕСЦЕНТНЫМ УЧЕТОМ РЕЗУЛЬТАТОВ В РЕЖИМЕ РЕАЛЬНОГО ВРЕМЕНИ. Проблемы особо опасных инфекций. 2017;(3):53-57. https://doi.org/10.21055/0370-1069-2017-3-53-57
For citation:
Kritsky A.A., Cheldyshova N.B., Tuchkov I.V., Smirnova N.I. DEVELOPMENT OF THE ALGORITHM FOR IDENTIFICATION OF THE LEVEL OF VIBRIO CHOLERAE CTXA AND TOXR GENE EXPRESSION USING RT-PCR WITH REAL-TIME HYBRIDIZATION-FLUORESCENT REGISTRATION OF RESULTS. Problems of Particularly Dangerous Infections. 2017;(3):53-57. (In Russ.) https://doi.org/10.21055/0370-1069-2017-3-53-57
Просмотров:
860
Послать статью по эл. почте 