Конструирование рекомбинантного штамма Escherichia coli продуцента основной субъединицы токсин-корегулируемых пилей адгезии TcpA Vibrio cholerae биовара Эль Тор

Цель работы. Конструирование рекомбинантного штамма E. coli, продуцента белка TcpA возбудителя холеры Эль Тор, несущего в геноме ген tсрАCIRS, и его использование для получения антигена. Материалы и методы. В работе использовали нетоксигенный штамм геновариант Vibrio cholerae биовара Эль Тор из ГКПБ ФКУЗ РосНИПЧИ «Микроб», а также коммерческие штаммы Escherichia coli и плазмиды для клонирования фирмы Invitrogen, США. Хромосомную ДНК из клеток V. cholerae выделяли с помощью набора Charage Smitch gDNA Mini Bacteria Kit методом нуклеосорбции. Для выделения плазмидной ДНК из клеток E. coli использовали набор PureLink Quick Plasmid DNA MiniprepKits. Присутствие гена tсрАCIRS определяли в ПЦР, используя рассчитанные нами праймеры. Фрагменты ДНК выделяли из агарозного геля с помощью набора PCR Clear-Up-System. SDSPAGE проводили по методу U.K.Laemmli. Концентрацию белка в пробах измеряли методом M.M.Bradford. Для очистки рекомбинантного белка TcpA применяли набор для аффиной хроматографии. Результаты и выводы.
Сконструирован безопасный штамм E. coli – продуцент рекомбинантного белка TcpA – основной субъединицы токсин-коррегулируемых пилей адгезии возбудителя холеры Эль Тор. Участок гена tcpA V. cholerae биовара Эль Тор был клонирован в составе векторной плазмиды pET302 по сайтам рестрикции XhoI-BamHI в штамм E. coli BL21(DE3)Star. В этой конструкции биосинтез протеина находится под транскрипционным контролем промотора фага Т7 и индуцируется с помощью изопропил-β-тиогалактопиранозида (ИПТГ). Отработаны условия оптимальной продукции белка TcpA и схема его очистки с помощью аффинной хроматографии. Показано, что TcpA присутствует в клетках кишечной палочки как в нативной форме, так и в виде телец включения. Общая продукция белка TcpA составляет 60 мкг/мл. Полученный очищенный белок TcpA может быть использован для изучения его иммуногенных и физико-химических свойств, а также для разработки иммунодиагностических препаратов с целью оценки уровня продукции TcpA у различных штаммов V. cholerae и определения антигенного состава холерных вакцинных препаратов.

1. Кельциева О.А., Гладилович В.Д., Подольская Е.П. Металл-аффинная хроматография. Основы и применение. Научное приборостроение. 2013; 23(1):74–85.

2. Смирнова Н.И., Горяев А.А., Кутырев В.В. Эволюция генома возбудителя холеры в современный период. Мол. генет., микробиол. и вирусол. 2010; 4:11–9.

3. Смирнова Н.И., Заднова С.П., Агафонов Д.А., Шашкова А.В., Челдышова Н.Б., Черкасов А.В. Сравнительный молекулярно-генетический анализ мобильных элементов природных штаммов возбудителя холеры. Генетика. 2013; 49(9):1036–47. DOI: 10.7868/S0016675813090087.

4. Полунина Т.А., Варшавская Ю.С., Заднова С.П., Краснов Я.М. Применение 2D-электрофореза для получения «белковых портретов» лизатов бактериальных культур возбудителей особо опасных инфекций. Пробл. особо опасных инф. 2016; 1:97–101.

5. Bradford M.M. Rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal. Biochem. 1976; 72:248–54.

6. Craig L., Taylor R.K., Pique M.E., Adair B.D., Arvai A.S., Singh M., Lloyd S.J., Shin D.S., Getzoff E.D., Yeager M., Forest K.T., Tainer J.A. Type IV pilin structure and assembly: X-ray and EM analyses of Vibrio cholerae toxin-coregulated pilus and Pseudomonas aeruginosa PAK pilin. Mol. Cell. 2003; 11(5):1139–50. DOI: 10.1016/S1097-2765(03)00170-9.

7. Grunberg-Manago M. Messenger RNA Stability and its role in control of gene expression in bacteria and phages. Annu. Rev. Genet. 1999; 33:193–227.

8. Kado C.I., Liu S.T. Rapid procedure for detection and isolation of large and small plasmids. J. Bacteriol. 1981; 145(3):1365–73.

9. Kiaie S., Abtahi H., Mosayebi G., Alikhani M.Y., Pakzad I. Recombinant toxin-coregulated pilus A (TcpA) as a candidate subunit cholera vaccine. Iran. J. Microbiol. 2013; 6(2):68–73.

10. Laemmli U.K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T. Nature. 1970; 227(5259):680–5.

11. Matreja A., Kim D.W., Thomson N., Connor T.R., Lee J.H., Kariuki S. Evidence for multiple waves of global transmission within the seventh cholera pandemic. Nature. 2013; 477(7365):462–5. DOI: 10.1038/nature10392.

12. Molaee N., Mosayebi G., Amozande-Nobaveh A., Soleyman M.R., Abtahi H. Evolution of the immune response against recombinant proteins (TcpA, TcpB and FlaA) as a candidate subunit cholera vaccine. J. Immunol. Res. 2017:2412747. DOI: 10.1155/2017/2412747.

13. Price G.A., Holmes R.K. Immunizing adult female mice with a TcpA-A2-CTB chimera provides a high level of protection for their pups in the infant mouse model of cholera. PLoS Negl. Trop. Dis. 2014; 8(12):e3356. DOI: 10.1371/journal.pntd.0003356.

14. Rollenhagen J.E., Kalsy A., Cerda F., Manohar J., Harris J.B., LaRocque R.C., Qadri F., Calderwood S.B., Taylor R.K., Ryan E.T. Transcutaneous immunization with toxin-coregulated pilin A induces protective immunity against Vibrio cholerae O1 El Tor challenge in mice. Infect. Immun. 2006; 74:5834–9. DOI: 10.1128/IAI.00438-06.

15. Sun D., Lafferty M.J., Peek J.A., Taylor R.K. Domains within the Vibrio cholerae toxin-coregulated pilin subunit that mediate bacterial colonization. Gene. 1997; 192(1):79–85. DOI: 10.1016/S0378-1119(97)00007-3.