Масс-спектрометрический анализ природных и антиген-измененных штаммов туляремийного микроба

Цель работы. Сравнительное изучение белковых профилей типичных вирулентных и изогенных авирулентных ЛПС-дефектных штаммов туляремийного микроба с помощью масс-спектрометрического анализа. Материалы и методы. В работе использовали 6 родительских вирулентных (трех основных подвидов) и 8 изогенных авирулентных штаммов Francisella tularensis, имеющих различные повреждения в структуре ЛПС. Получение спектров исследуемых культур методом MALDI-TOF MS проводили с использованием масс-спектрометра Autoflex speed III Bruker Daltonics и программного обеспечения Flex Control, идентификацию – с помощью программы Biotyper, база данных которой была расширена нами ранее внесением масс-спектров 40 типичных штаммов F. tularensis трех основных подвидов. Результаты и выводы. При оценке влияния пробоподготовки образцов на качество снимаемых спектров с помощью трех методов (экстракция матрицей, ТФУ и этиловым спиртом) показано, что наиболее эффективным является метод обработки бактерий этиловым спиртом и муравьиной кислотой.
Согласно полученным данным, типичные вирулентные штаммы туляремийного микроба трех основных подвидов имеют существенные различия в мажорных пиках, что позволяет использовать MALDI-TOF MS для проведения подвидовой дифференциации. Вместе с тем при сравнительном изучении белковых спектров вирулентных и авирулентных штаммов F. tularensis принципиальных отличий не выявлено. При этом нам удалось обнаружить единичные масс-спектры m/z 4673, 6929, характерные для вирулентных, и m/z 7256 – для авирулентных штаммов.
Таким образом, метод MALDI-TOF MS дает возможность достоверно определять подвидовую принадлежность штамма, однако не позволяет проводить дифференциацию штаммов разной степени вирулентности. Результаты выявили, что MALDI-TOF может быть полезным как при идентификации типичных, так и антиген-измененных ЛПС-дефектных штаммов F. tularensis.

1. Афанасьев М.В., Миронова Л.В., Балахонов С.В. MALDITOF масс-спектрометрический анализ для идентификации возбудителей чумы, холеры и туляремии. Мол. генет., микробиол. и вирусол. 2015; 33(2):3–8. DOI: 10.3103/S0891416815020020.

2. Мещерякова И.С., Добровольский А.А., Демидова Т.Н., Кормилицына М.И., Михайлова Т.В. Трансмиссивная эпидемическая вспышка туляремии в г. Ханты-Мансийске в 2013 году. Эпидемиол. и вакцинопрофилакт. 2014; 5(78):14–20.

3. Павлович Н.В., Мишанькин Б.Н. Прозрачная питательная среда для культивирования Francisella tularensis. Антибиотики и мед. биотехнол. 1987; 32(2):133–7.

4. Павлович Н.В., Мишанькин Б.Н., Шиманюк Н.Я., Рыжкова В.В., Данилевская Г.И., Михалевич Р.В. Характеристика биологических свойств бескапсульных вариантов Francisella tularensis. Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунобиол. 1993; 3:21–30.

5. Павлович Н.В., Тынянова В.И. Возможные механизмы реализации токсического потенциала липополисахаридов патогенных бактерий. Мол. генет., микробиол. и вирусол. 2005; 2:9–12.

6. Chambers M.C., Maclean B., Burke R., Amodei D., Ruderman D.L., Neumann S., Gatto L., Fischer B., Pratt B., Egertson J., Hoff K., Kessner D., Tasman N., Shulman N., Frewen B., Baker T.A., Brusniak M.Y., Paulse C., Creasy D., Flashner L., Kani K., Moulding C., Seymour S.L., Nuwaysir L.M., Lefebvre B., Kuhlmann F., Roark J., Rainer P., Detlev S., Hemenway T., Huhmer A., Langridge J., Connolly B., Chadick T., Holly K., Eckels J., Deutsch E.W., Moritz R.L., Katz J.E., Agus D.B., MacCoss M., Tabb D.L., Mallick P. A cross-platform toolkit for mass spectrometry and proteomics. Nat. Biotechnol. 2012; 30:918–20. DOI: 10.1038/nbt.2377.

7. Drevinek М., Dresler J., Klimentova J., Pisa L., Hubalek М. Еvaluation of sample preparation methods for MALDI-TOF MS identification of highly dangerous bacteria Lett. Appl. Microbiol. 2012; 55(1):40–4. DOI: 10.1111/j.1472-765X.2012.03255.x.

8. Jiang J.J., Parker C.E., Fuller J.R., Kawula T.H., Borchers C.H. An Immunoaffinity tandem mass spectrometry (iMALDI) assay for detection of Francisella tularensis. Anal. Clin. Acta. 2007; 605(1):70–9.

9. Karatuna О., Çelebi B., Can S., Akyar I., Kiliç S. The use of matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry in the identification of Francisella tularensis. Bosn. J. Basic Med. Sci. 2016; 16(2):132–8. DOI: org/10.17305/ bjbms.2016.894.

10. Lai X.H., Zhao L.F., Chen X.M., Ren Y. Rapid identification and characterization of Francisella by molecular biology and other techniques. Open Microbiol. J. 2016; 10(suppl. 1):64–77. DOI: 10.2174/1874285801610010064.

11. López-Fernández H., Santos H.M., Capelo J.L., FdezRiverola F., Glez-Peña D., Reboiro-Jato M. Mass-Up: an all-inone open software application for MALDI-TOF mass spectrometry knowledge discovery. BMC Bioinformatics. 2015; 16:318. DOI: org/10.1186/s12859-015-0752-4.

12. McLendon M.K., Apicella M.A., Allen L-A.H. Francisella tularensis taxonomy, genetics and immunopathogenesis of potential agent of biowarfare. Annu. Rev. Microbiol. 2006; 60:167–185. DOI: 10.1146/annurev.micro.60.080805.142126.

13. Twine S., Vinogradov E., Lindgren H., Sjostedt A., Conlan J. Roles for wbtC, wbtI, and kdtA genes in lipopolysaccharide biosynthesis, protein glycosylation, virulence, and immunogenicity in Francisella tularensis strain SCHU S4. Pathogens. 2012; 1:12–29. DOI: 10.3390/pathogens1010012.