Разработка иммуноферментной тест-системы для выявления Bacillus anthracis

Цель. Создание иммуноферментной тест-системы для выявления спор Вacillus anthracis. Материалы и методы. В работе использованы штаммы из государственной коллекции микроорганизмов филиала ФГБУ «48ЦНИИ» Минобороны России (г.Киров) и мыши линии BALB/c. Гибридизацию В-лимфоцитов и миеломных клеток SP2/0-Ag14 проводили по методике G. Kohler и C. Milstein в модификации De St. Fazekas и P. Scheidegger. Клетки гибридом культивировали в перитонеальной полости мышей линии BALB/с. Моноклональные антитела выделяли из асцитных жидкостей осаждением сульфатом аммония и очисткой ионообменной хроматографией. Исследование специфической активности супернатантов гибридом, асцитных жидкостей, очищенных моноклональных антител  проводили  «сэндвич» - методом  иммуноферментного  анализа. Специфические  компоненты  создаваемых тест-систем подвергали сублимационному высушиванию в соответствующих защитных средах. Результаты и выводы. Получены гибридные клеточные линии, продуцирующие специфические моноклональные антитела к споровым  антигенам В. anthracis,  и  асцитные  жидкости,  из  которых  выделены  иммуноглобулины. Подобраны оптимальные сочетания моноклональных антител в качестве сенситина и в составе иммуноферментного конъюгата. Наибольшую чувствительность иммуноферментного анализа при выявлении споровых антигенов сибиреязвенного микроба обеспечила пара сенситин–конъюгат: 272E10G1–272F7A10. Определена оптимальная концентрация иммуноглобулинов для сенсибилизации планшета. Разработана иммуноферментная тест-система для вы-явления спор В. anthracisс пределом обнаружения 5,0·10⁵ спор/мл. Показано отсутствие перекрестных реакций с близкородственными сапрофитами и гетерологичными микроорганизмами в концентрации 1,0·10⁸ м.к./мл.

1. Еременко Е.И., Рязанова А.Г., Буравцева Н.П. Современная ситуация по сибирской язве в России и мире. Основные тенденции и особенности. Проблемы особо опасных инфекций. 2017; 1:65–71. DOI: 10.21055/0370-1069-2017-1-65-71.

2. Кэтти Д., Редактор. Антитела. Методы. М.: Мир; 1991. Т. 1. 287 С.

3. Нетрусов А.И., Редактор. Практикум по микробиологии: Учеб. пособие для студ. высш. учеб. заведений. М.: Издательский центр «Академия»; 2005. 608 с.

4. Онищенко Г.Г., Кожухов В.В., Редакторы. Сибирская язва: актуальные проблемы разработки медицинских средств защиты. М.: ОАО «Издательство «Медицина»; 2010. 424 с.

5. Онищенко Г.Г., Кутырев В.В., Редакторы. Лабораторная диагностика опасных инфекционных болезней. Практическое руководство. М.: ЗАО «Шико»; 2013. 560 с.

6. Павлов Д.Л., Онучина Н.В., Кузнецовский А.В., Фоменков О.О., Туманов А.С. Результаты исследования биологических и генетических свойств сибиреязвенных изолятов эпизоотии 2016 года в Ямало-Ненецком автономном округе. Вестник войск РХБ защиты. 2017; 1(1):23–32.

7. Терешкина Н.Е., Девдариани З.Л. Современное состояние проблемы иммунодетекции возбудителя сибирской язвы. Проблемы особо опасных инфекций. 2008; 1:44–8.

8. Bartholomew R.A., Ozanich R.M., Arce J.S., Engelmann H.E., Heredia-Langner A., Hofstad B.A., Hutchison J.R., Jarman K., Melville A.M., Victry K.D., Bruckner-Lea C.J. Evaluation of Immunoassays and General Biological Indicator Tests for Field Screening of Bacillus anthracis and Ricin. Health Secur. 2017; 15:81–95. DOI: 10.1089/hs.2016.0044.

9. Fazekas de St. Groth S., Scheidegger D. Production of monoclonal antibodies: strategy and tactics. J. Immunol. Meth. 1980; 35:1–21.

10. Köhler G., Milstein C. Continuous culture of fused cells secreting antibody of predefined specificity. Nature. 1975; 256(5517):495–7.

11. Lowry O.H., Rosebrough N.J., Farr A.L., Randall R.J. Protein measurement with the Folin phenol reagent. J. Biol. Chem. 1951; 193 (1):265–75.

12. Nakane P.K., Kawaoi A. Peroxidase-labeled antibody a new method of conjugated. J. Histochem. Cytochem. 1974; 22(12):1084–1091.

13. Wang D.-B., Yang R., Zhang Z.-P., Bi L.-J., You X.Y., Wei H.P., Zhou Y.F., Yu Z., Zhang X.E. Detection of B. anthracisspores and vegetative cels with the same monoclonal antibodies. PLoS ONE. 2009; 4(11): e7810. DOI: 10.1371/journal.pone.0007810.