Поиск генетических маркеров вируса клещевого энцефалита для его специфичной индикации

Цель исследования – анализ генетических маркеров вируса клещевого энцефалита, которые можно использовать для специфичной индикации максимально большего числа штаммов и изолятов вируса.

Материалы и методы. В качестве амплифицируемого материала использовалась плазмидная ДНК и нуклеиновые кислоты клещей рода Ixodes и Dermacentor. Полимеразную цепную реакцию осуществляли на амплификаторе «C1000» с оптическим блоком «CFX96» (BioRad). Видовое (штаммовое) разнообразие выявляемых с применением анализируемых генетических маркеров организмов определяли в программной утилите «nBLAST». Дизайн нуклеотидных последовательностей праймеров и зондов проводили, используя программу «Vector NTI 9.1.0» (Invitrogen Corporation). Выделение нуклеиновых кислот производили методом магнитной сорбции с комплектом реагентов «МАГНО-сорб». Праймеры и зонды синтезировали в ЗАО «Евроген» (Москва, Россия). Для ПЦР использовались реактивы производства ЗАО «Синтол» (Москва, Россия).

Результаты и обсуждение. При индикации генома вируса клещевого энцефалита основным критерием выбора маркерной последовательности является специфичное выявление нуклеиновых кислот только искомого микроорганизма. Для поиска специфичной маркерной нуклеотидной последовательности произведен анализ полногеномных нуклеотидных последовательностей различных штаммов и изолятов вируса клещевого энцефалита. Взаимное сравнение всех указанных выше геномов позволило определить семь условно консервативных локусов, характеризующихся минимальной вариабельностью нуклеотидов. Опираясь в дальнейшей работе на результаты выравнивания нуклеотидных последовательностей изолятов вируса клещевого энцефалита, в том числе учитывая нуклеотидные последовательности гетерогенных микроорганизмов, выполнен дизайн праймеров и зондов для амплификации каждого из маркерных локусов, наиболее аналитически значимые олигонуклеотиды разработаны на основе локусов 4 и 7. Амплификация с олигонуклеотидными затравками для индикации вируса клещевого энцефалита была результативной как в отдельной ПЦР с положительным контролем, так и в сочетании с ДНК клещей.

вирус клещевого энцефалита, специфичность, полиморфизм генома, пцр, локусы, генетические маркеры, олигонуклеотиды, индикация

1. Туник Т.В., Ляпунов А.В., Хаснатинов М.А., Данчинова Г.А., Арбатская Е.В., Чапоргина Е.А., Каверзина А.С., Петрова И.В., Савелькаева М.В., Горбунова Е.Л. Эффективность антибиотикопрофилактики болезни Лайма (клещевого боррелиоза) у лиц, пострадавших от укусов иксодовых клещей. Acta Biomedica Scientifica. 2012; (2–1):67–70.

2. Madison-Antenucci S., Kramer L.D., Gebhardt L.L., Kauffman E. Emerging tick-borne diseases. Clin. Microbiol. Rev. 2020; 33(2):e00083-18. DOI: 10.1128/CMR.00083-18.

3. Ляпунов А.В., Данчинова Г.А., Хаснатинов М.А., Туник Т.В., Арбатская Е.В., Петрова И.В., Савелькаева М.В., Горбунова Е.Л., Гладкова Е.П. Встречаемость антигена вируса клещевого энцефалита у населения, пострадавшего от укусов иксодовых клещей. Бюллетень Восточно-Сибирского научного центра Сибирского отделения Российской академии медицинских наук. 2013; (2–2):115–8.

4. Оглезнева Е.Е., Ильина Т.М., Чеботарева Т.Я. Ситуация по заболеваемости инфекциями, передающимися при укусах клещей, и мерах их профилактики на территории Белгородской области за период 2015 – 8 месяцев 2017 гг. Инфекция и иммунитет. 2017; S:476.

5. Данчинова Г.А., Ляпунов А.В., Манзарова Э.Л., Ляпунова Н.А., Соловаров И.С., Петрова И.В., Хаснатинов М.А. Необходимость совершенствования экстренной диагностики клещевых инфекций у людей, пострадавших от укусов иксодовых клещей за пределами России. Acta Biomedica Scientifica. 2018; 3(4):129–37. DOI: 10.29413/ABS.2018-3.4.19.

6. Конев В.П. Клещевой энцефалит: патоморфология и молекулярная патология. Дальневосточный журнал инфекционной патологии. 2007; 11:87–90.

7. Пиневич О.С., Попонникова Т.В., Вахрамеева Т.Н., Бедарева Т.Ю., Галиева Г.Ю., Берданова В.С. Клинические и этиологические аспекты клещевых микст-инфекций у детей. Мать и дитя в Кузбассе. 2008; 3:30–5.

8. Леонова Г.Н., Крылова Н.В., Павленко Е.В., Беликов С.И., Кондратьев И.Г. Значение дальневосточных штаммов вируса клещевого энцефалита в инфекционной патологии. Здоровье населения и среда обитания. 2012; 1:4–6.

9. Хусаинов Ф.М., Евстифеев В.В., Хусаинова Г.И., Хамидуллина Р.З., Фазулзянов И.Р., Яковлев С.И. Клинико-эпизоотологическое проявление хламидийного аборта у коз. Ветеринарный врач. 2018; 3:41–4.

10. Гумеров В.Г., Евстифеев В.В., Макаев Х.Н., Галиуллин А.К., Каримуллина И.Г., Коннов М.Н. Эпизоотологический и серологический мониторинг смешанных респираторно-кишечных инфекций крупного рогатого скота. Ученые записки Казанской государственной академии ветеринарной медицины им. Н.Э. Баумана. 2019; 237(1):56–60. DOI: 10.31588/2413-42011883-237-1-56-60.

11. Этенко Д.А., Громова О.А., Субботин А.В., Семенов В.А. Комплексная терапия очаговой формы смешанной клещевой энцефалит-боррелиозной инфекции. Неврология, нейропсихиатрия, психосоматика. 2016; 8(3):26–30. DOI: 10.14412/2074-2711-2016-3-26-30.

12. Носков А.К., Ильин В.П., Андаев Е.И., Пакскина Н.Д., Веригина Е.В., Балахонов С.В. Заболеваемость клещевым вирусным энцефалитом в российской федерации и по федеральным округам в 2009–2013 гг., эпидемиологическая ситуация в 2014 г. и прогноз на 2015 г. Проблемы особо опасных инфекций. 2015; 1:46–50. DOI: 10.21055/0370-1069-2015-1-46-50.

13. Khammadov N.I., Aleksandrova N.M., Khammadova A.V., Shuralev E.A. Evaluation of the Effectiveness of Genetic Markers of Mycobacteria for Assessing the Disinfection Quality by Viability Real Time PCR. BioNanoScience. 2019; 9:918–27. DOI: 10.1007/s12668-019-00654-8.

14. Khammadova A.V., Shuralev E.A., Khammadov N.I., Oumarou B.M., Faizov T.K., Mukminov M.N. Design of primers for identification of honey bee viruses in multiplex-PCR. Astra Salvensis. 2017; 2017:481–90.