Разработка и апробация способа выявления РНК вируса Луйо методом обратной транскрипции и полимеразной цепной реакции в режиме реального времени

Цель – разработка и оценка эффективности способа выявления РНК вируса Луйо в пробах клинического и биологического материала с помощью одношаговой ОТ-ПЦР с учетом результатов в режиме реального времени.

Материалы и методы. Для подбора консервативных участков генома использовали доступные в базе данных GenBank (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank) последовательности вируса Луйо, выровненные с использованием программного пакета BioEdit 7.2.5 (IbisBiosciences, США). Для проведения ОТ-ПЦР в одном раунде использовали обратную транскриптазу и TaqF-полимеразу. Для создания положительного контрольного образца (ПКО) получали рекомбинантный штамм Escherichia coli XL1-Вlue, содержащий плазмиду pGEM-T со встроенным синтетически полученным фрагментом генома вируса. Сконструированные рекомбинантные плазмиды использовали для создания РНК-содержащего ПКО с защитной белковой оболочкой MS2-фага. Определение специфичности разработанного способа осуществляли с использованием контрольной панели РНК и ДНК 23 штаммов вирусов, относящихся к 10 семействам, чувствительности – панели биологических образцов, искусственно контаминированных ПКО. Дальнейшую апробацию проводили на базе лаборатории Российско-Гвинейского центра эпидемиологии и профилактики инфекционных болезней (г. Kindia, Гвинейская Республика) на 265 сыворотках крови практически здоровых людей, 110 сыворотках крови крупного рогатого скота, 83 суспензиях клещей, 165 суспензиях органов мелких млекопитающих, собранных на территории Гвинеи.

Результаты и обсуждение. В качестве мишени для детекции РНК вируса Луйо методом ОТ-ПЦР выбраны два консервативных фрагмента гена полимеразы. Экспериментально подобрано сочетание праймеров и зондов, установлен оптимальный состав реакционной смеси для проведения ПЦР, режим постановки ОТ-ПЦР, а также разработаны контрольные образцы К+, внутренний контрольный образец, положительный контрольный образец. Чувствительность предложенного способа составила 5·10³  ГЭ/мл, специфичность – 100 %. 

1. Paweska J.T., Sewlall N.H., Ksiazek T.G., Blumberg L.H., Hale M.J., Lipkin W.I., Weyer J., Nichol S.T., Rollin P.E., McMullan L.K., Paddock C.D., Briese T., Mnyaluza J., Dinh T.H., Mukonka V., Ching P., Duse A., Richards G., de Jong G., Cohen C., Ikalafeng B., Mugero C., Asomugha C., Malotle M.M., Nteo D.M., Misiani E., Swanepoel R., Zaki S.R. Nosocomial outbreak of novel arenavirus infection, Southern Africa. Emerg. Infect. Dis. 2009; 15(10):1598– 602. DOI: 10.3201/eid1510.090211.

2. Briese T., Paweska J.T., McMullan L.K., Hutchison S.K., Street C., Palacios G., Khristova M.L., Weyer J., Swanepoel R., Egholm M., Nichol S.T., Lipkin W.I. Genetic detection and characterization of Lujo virus, a new hemorrhagic fever-associated arenavirus from Southern Africa. PLoS Pathog. 2009; 5(5):e1000455. DOI: 10.1371/journal.ppat.1000455.

3. Ishii A., Thomas Y., Moonga L., Nakamura I., Ohnuma A., Hang'ombe B.M., Takada A., Mweene A.S., Sawa H. Molecular surveillance and phylogenetic analysis of Old World arenaviruses in Zambia. J. Gen. Virol. 2012; 93(Pt 10):2247–51. DOI: 10.1099/vir.0.044099-0.

4. Сизикова Т.Е., Лебедев В.Н., Сыромятникова С.И., Борисевич С.В. Геморрагическая лихорадка Луйо. Вопросы вирусологии. 2017; 62(4):149–53. DOI: 10.18821/0507-4088-2017-62-4-149-153.

5. Atkinson B., Chamberlain J., Dowall S.D., Cook N., Bruce C., Hewson R. Rapid molecular detection of Lujo virus RNA. J. Virol. Methods. 2014; 195:170–3. DOI: 10.1016/j.jviromet.2013.09.006.

6. Найденова Е.В., Дедков В.Г., Сафонова М.В., Сеничкина А.М., Агафонов Д.А., Захаров К.С., Щербакова С.А., Кутырев В.В. Разработка методики выявления РНК вируса Луйо с использованием полимеразной цепной реакции с гибридизационнофлуоресцентной детекцией. В кн.: Покровский В.И., редактор. Сборник трудов Международной научно-практической конференции «Молекулярная диагностика 2018». Минск: СтройМедиаПроект; 2018. С. 453–4.