Использование chi-последовательности для дифференциации штаммов возбудителя сибирской язвы от близкородственных бацилл

Целью работы было сравнение микроорганизмов, принадлежащих к шести различным видам рода Bacillus , по распределению подвижности ампликонов, полученных с использованием праймера, содержащего chi-последовательность Bacillus subtilis . В работе были проанализированы 30 штаммов Bacillus anthracis и близкородственных бацилл. Культуры выращивали на L-агаре и в L-бульоне при температуре 37 °С. ДНК выделяли из вегетативных культур B. anthracis и Bacillus spp. с использованием лизоцима и фенольной депротеинизации. Для однопраймерной ПЦР был сконструирован праймер ChiBs - 5`-CTAGGAGCGGG-3`. Однопраймерную амплификацию (30 циклов) проводили при температуре отжига 47 °С. Сравнительный анализ индивидуальных электрофоретических профилей ампликонов, полученных в реакции ПЦР с помощью праймера, содержащего chi-последовательность B. subtilis, позволяет выявлять генетическую внутривидовую вариабельность и проводить дифференциацию штаммов B. anthracis от атипичных штаммов и близкородственных видов бацилл.

Bacillus anthracis, дифференциация, ПЦР, chi-последовательность, Bacillus anthracis, differentiation, PCR, chi-sequence

1. Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Дж. Молекулярное клонирование. М.: Мир; 1984. 479 с.

2. Маринин Л.И., Дятлов И.А., Мокриевич А.Н., Бахтеева И.В., Белова Е.В., Борзилов А.И., Комбарова Т.И., Кравченко Т.Б., Миронова Р.И., Попова В.М., Сомов А.Н., Титарева Г.М., Тюрин Е.А., Чекан Л.В., Шишкина О.Б., Шишкова Н.А. Методы изучения биологических свойств возбудителя сибирской язвы. Оболенск; 2009. 304 с.

3. Обеззараживание исследуемого материала, инфицированного бактериями I-IV групп при работе методом ПЦР. МУ 3.5.5.1034.01. М.: МЗ РФ; 2001. 8 с.

4. Рязанова А.Г., Еременко Е.И., Цыганкова О.И., Цыганкова Е.А., Куличенко А.Н. Использование методов молекулярного типирования Bacillus anthracis в референс-центре по мониторингу за возбудителем сибирской язвы. Пробл. особо опасных инф. 2011; 110(4):68-70.

5. Andersen G.L., Simchock J.M., Wilson K.H. Identification of a region of genetic variability among Bacillus anthracis strains and related species. J. Bacteriol. 1996; 178(1):377-84.

6. Biswas I., Maguin E., Ehrlich S.D., Gruss A.A. 7-base-pair sequence protects DNA from exonucleolytic degradation in Lactococcus lactis. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1995; 92:2244-8.

7. Chédin F., Kowalczykowski S.C. A novel family of regulated helicases/nucleases from Gram-positive bacteria: insights into the initiation of DNA recombination. Mol. Microbiol. 2002; 43:823-34.

8. Chédin F., Noirot P., Biaudet V., Ehrlich S.D. A five-nucleotide sequence protects DNA from exonucleolytic degradation by AddAB, the RecBCD analogue of Bacillus subtilis. Mol. Microbiol. 1998; 29:1369-77.

9. Helgason E., Okstad O.A., Caugant D.A., Johansen H.A., Fouet A., Mock M., Hegna I., Kolsto A.B. Bacillus anthracis, Bacillus cereus and Bacillus thuringiensis - one species on the basis of genetic evidence. Appl. Environ. Microbiol. 2000; 66:2627-30.

10. Keim P., Price L.B., Klevytska A.M., Smith K.L., Schupp J.M., Okinaka R., Jackson P.J., Hugh-Jones M.E. Multiple-locus variable-number tandem repeat analysis reveals genetic relationships within Bacillus anthracis. J. Bacteriol. 2000; 182:2928-36.

11. Le Flèche P., Hauck Y., Onteniente L., Prieur A., Denoeud F., Ramisse V., Sylvestre P., Benson G., Ramisse F., Vergnaud G. A tandem repeats database for bacterial genomes: application to the genotyping of Yersinia pestis and Bacillus anthracis. BMC Microbiol. 2001; 1(2):2180-93.

12. Patra G., Vaissaire J., Weber-Levy M., Le Doujet C., Mock M. Molecular characterization of Bacillus strains involved in outbreaks of anthrax in France in 1997. J. Clin. Microbiol. 1998; 36:3412-14.

13. Ramisse V., Patra G., Garringue H., Guesdon J-L., Mock M. Identification and characterization of Bacillus anthracis by multiplex PCR analysis of sequences on plasmids pXO1 and pXO2 and chromosomal DNA. FEMS Microbiol. Lett. 1996; 145:9-16.

14. Roloff H., Glockner P., Mistele K., Bohm R. The taxonomic relationship between B. anthracis and B. cereus group, investigated by DNA-DNA hybridization and DNA amplification fingerprinting (DAF). Proceedings of the International Workshop on Anthrax. Ed. P. C. B. Turnbull. Salisbury Medical Bulletin. 1996; 87, Special Supplement:38-9.

15. Shangkuan Y.H., Chang Y.H., Yang J.F., Lin H.C., Shaio M.F. Molecular characterization of Bacillus anthracis using multiplex PCR, ERIC-PCR and RAPD. Lett. Appl. Microbiol. 2001; 65(3):139-45.

16. Smith G.R., Roberts C.M., Schultz D.W. Activity of Chi recombinational hot spots in Salmonella typhimurium. Genetics. 1986; 112:429-39.

17. Sourice S., Biaudet V., El. Karoui M., Ehrlich S.D., Gruss A. Identification of the Chi site of Haemophilus influenzae as several sequences related to the Escherichia coli Chi site. Mol. Microbiol. 1998; 27(5):1021-9.