Новый способ получения липополисахарида возбудителя чумы

Предложено два варианта нового метода, оптимизирующего условия получения и очистки ЛПС из штаммов Y. pestis , а также позволяющего исключить применение ядовитых и трудноудаляемых реактивов, упростить и удешевить методику, рационально утилизировать отходы производства. Метод включает предварительную водносолевую экстракцию бактерий для удаления легкорастворимых веществ с последующим разрушением их ультразвуком в лизирующем буфере (0,1 М Трис-HCl, рН 8,0; 10 ммоль ЭДТА, 1 % Тритон Х-100). Для депротеинизации неочищенного эндотоксина в первом случае используется коммерческая протеиназа К (Sigma), а во втором - ферментный комплекс протеовибрин, выделенный из отхода производства вакцины холерной бивалентной химической. Для очистки ЛПС от нуклеиновых кислот введена процедура подкисления образца ледяной уксусной кислотой до рН 3,2-3,4. Варианты способа позволяют улучшить качество препаратов ЛПС относительно метода-прототипа и получать эндотоксин возбудителя чумы, практически не отличающийся по физико-химической характеристике, гомогенности, иммунохимической активности и специфичности от антигена, полученного классической водно-фенольной экстракцией по О.Westphal.

Yersinia pestis, липополисахарид, протеовибрин, Yersinia pestis, lipopolysaccharide, proteovibrin

1. Бурыгин Г.Л., Матора Л.Ю., Щеголев С.Ю. Способ получения липополисахаридов. Патент РФ 2237719, опубл. 10.10.2004.

2. Захарова И.Я., Косенко Л.В. Методы изучения микробных полисахаридов. Киев: Наукова думка; 1982. 192 с.

3. Марков Е.Ю., Николаев В.Б. Способ получения бактериальных липополисахаридов. Патент РФ 2051969, опубл. 10.01.1996.

4. Махнева З.К., Вишнивецкая Т.А., Прохоренко И.Р. Влияние метода выделения на выход и состав липополисахаридов из фотосинтезирующих бактерий. Прикладная биохим. и микробиол. 1996; 32(4):444-7.

5. Кузьмиченко И.А., Громова О.В., Джапаридзе М.Н., Киреев М.Н., Белякова Н.И., Клокова О.Д. Тест-среды для определения активности твиназы, протеазы и фосфолипазы в холерной химической вакцине и ее компонентах. Пробл. особо опасных инф. 2002; 1(83):148-53.

6. Кузьмиченко И.А., Громова О.В., Киреев М.Н, Плотников О.П., Грачева И.В., Виноградова Н.А., Солодовников Н.С., Червякова Н.С., Нижегородцев С.А., Антонычева М.В. Способ получения питательной основы и питательная среда для куль-тивирования микроорганизмов рода Yersinia и Vibrio. Патент РФ 2360962, опубл. 10.07.2009.

7. Darveau R.P., Hancock R.T.W. Procedure for isolation of bacterial lipopolysaccharides from both smooth and rough Pseudomonas aeruginosa and Salmonella thyphimurium strains. J. Bacteriol. 1983; 155(2):831-8.

8. Galanos C., Luderitz O., Westphal O. A new method for the extraction of R lipopolysaccharide. Eur. J. Biochem. 1969; 9:245-9.

9. Laemmli W.K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T 4. Nature. 1970; 227:680-5.

10. Hitchcock P.J., Brown T.M. Morphological heterogeneity among Salmonella lipopolysaccharide chemotypes in silverstained polyacrylamide gels. J. Bacteriol. 1983; 154:269-77.

11. Westphal O., Luderitz O., Bister F. Uber die Extraktion von Bakterien mit Phenol/Wasser. Z. Naturforsch. Teil B. 1952; 7:148-55.