Авирулентный пробиотический штамм Escherichia coli, продуцирующий B-субъединицу холерного токсина: получение, стабильность наследования и экспрессия клонированного гена ctxB

Цель исследования – получение продуцента B-субъединицы холерного токсина на основе авирулентного пробиотического штамма Escherichia coli M-17, изучение его молекулярно-генетических и иммуногенных свойств.

Материалы и методы. Использовали генетически маркированный штамм E. coli KS164 thy polA (pIEM3), содержащий рекомбинантную плазмиду с клонированным геном ctxB, кодирующим B-субъединицу холерного токсина, и авирулентный штамм Е. coli M-17, применяемый для производства колисодержащих пробиотиков. Анализ штаммов проводили различными методами: молекулярно-генетическими, биохимическими и иммунологическими.

Результаты и обсуждение. При введении методом конъюгации в клетки штамма Е. coli M-17 рекомбинантной коинтегратной плазмиды pIEM3(Km^RTc^R) с клонированным геном ctxB получены трансконъюганты Km^RTc^R с высоким уровнем продукции секретируемой B-субъединицы холерного токсина (10 мкг/мл), один из которых (КМ147) взят в качестве штамма-продуцента этого протективного антигена. Показано, что сконструированный штамм Е. coli KM147(pIEM3) Km^RTc^R стабильно наследует клонированный ген ctxB в составе рекомбинантной плазмиды, способен к образованию антитоксических антител у иммунизированных животных и безопасен для модельных животных. Совокупность этих свойств определяет перспективность его дальнейшего использования при конструировании профилактических и диагностических холерных препаратов.

1. Finkelstein R.A., LoSpalluto J.J. Pathogenesis of experimental cholera. Preparation and isolation of choleragen and chole¬ ragenoid. J. Exp. Med. 1969; 130(1):185–202. DOI: 10.1084/ jem.130.1.185.

2. Sears C.L., Kaper J.B. Enteric bacterial toxins: mechanisms of action and linkage to intestinal secretion. Microbiol. Rev. 1996; 60(1):167–215. DOI: 10.1128/mr.60.1.167-215.1996.

3. Waldor M.K., Mekalanos J.J. Lysogenic conversion by a flamentous phage encoding cholera toxin. Science. 1996; 272(5270):1910–4. DOI: 10.1126/science.272.5270.1910.

4. DOI: 10.1126/science.272.5270.1910. 4. Matson J.S., Withey J.H., DiRita V.J. Regulatory networks controlling Vibrio cholerae virulence gene expression. Infect. Immun. 2007; 75(12):5542–9. DOI: 10.1128/IAI.01094-07.

5. Гинцбург А.Л., Янишевский Н.В., Мотин В.Л., Шагинян И.А., Вертиев Ю.В., Смирнов Г.Б. Организация и клонирование структурных генов энтеротоксина Vibrio cholerae eltor RV79. Молекулярная генетика, микробиология и вирусология. 1984; (9):12–8.

6. Янишевский Н.В., Гинцбург А.Л., Вертиев Ю.В., Демме Ю.М., Каратаев Г.И., Смирнов Г.Б. Конструирование рекомбинантных плазмид, кодирующих биосинтез В-субъединицы холерного токсина. Молекулярная генетика, микробиология и вирусология. 1987; (4):26–32.

7. Ильина Т.С., Смирнов Г.Б., Смирнова Н.И., Ливанова Л.Ф. Рекомбинантная плазмидная ДНК pIEM3, кодирующая синтез В-субъединицы холерного токсина, способ ее конструирования и штамм бактерий Vibrio cholerae – продуцент В-субъединицы холерного токсина. Авторское свидетельство № 1505022 СССР, опубл. 15.10.1991. Бюл. № 38.

8. Перетц Л.Г. Значение нормальной микрофлоры для организма человека. М.: Медгиз; 1955. 436 с.

9. Белова И.В., Точилина А.Г., Соловьева И.В., Ефимов Е.И., Горлова И.С., Иванова Т.П., Жирнов В.А. Результаты генетического анализа пробиотического штамма Escheriсhia coli M-17 и потенциально пробиотического штамма Escheriсhia coli ВМ. Микробиология. 2019; 88(3):328–35. DOI: 10.1134/ S0026365619030030.

10. Смирнова Н.И., Крепостнова И.М., Ливанова Л.Ф., Заднова С.П., Еремин С.А., Ильина Т.С. Авирулентный штамм Vibrio cholerae – продуцент B-субъединицы холерного токсина: получение и молекулярно-генетический анализ. Молекулярная генетика, микробиология и вирусология. 2007; (4):7–13.

11. Nair G.B., Faruque S.M., Bhuiyan N.A., Kamruzzaman M., Siddique A.K., Sack D.A. New variants of Vibrio cholerae O1 biotype El Tor with attributes of the classical biotype from hospitali¬ zed patients with acute diarrhea in Bangladesh. J. Clin. Microbiol. 2002; 40(9):3296–9. DOI: 10.1128/JCM.40.9.3296-3299.2002.

12. Hu D., Liu B., Feng L., Ding P., Guo X., Wang M., Cao B., Reeves P.R., Wang L. Origins of the current seventh cholera pande¬mic. Proc. Natl Acad. Sci. USA. 2016; 113(48):E7730-Е7739. DOI: 10.1073/pnas.1608732113.

13. Смирнова Н.И., Баданин Д.В., Рыбальченко Д.А., Краснов Я.М., Крицкий А.А., Лозовский Ю.В., Федоров А.В., Кутырев В.В. Изменчивость генома холерных вибрионов Эль Тор, выделенных до начала и в разные периоды текущей пандемии холеры. Молекулярная генетика, микробиология и вирусология. 2021; 39(2):25–37. DOI: 10.17116/molgen20213902125.

14. Olsvik O., Wahlberg J., Petterson B., Uhlén M., Popovic T., Wachsmuth I.K., Fields P.I. Use of automated sequencing of polymerase chain reaction-generated amplicons to identify three types of cholera toxin subunit B in Vibrio cholerae O1 strains. J. Clin. Microbiol. 1993; 31(1):22–5. DOI: 10.1128/jcm.31.1.22-25.1993.

15. Bhaskaran K., Rowley D. Nutritional studies on Vibrio cholerae. J. Gen. Microbiol. 1956; 15(2):417–22. DOI: 10.1099/00221287-15-2-417.

16. Finkelstein R.A., Atthasampunna P., Chulasamaya M., Charunmethee P. Pathogenesis of experimental cholera: biologic activities of purified procholeragen A. J. Immunol. 1966; 96(3):440–9.

17. Bradley D.E., Taylor D.E., Cohen D.R. Specification of surface mating system among conjugative drug resistance plasmids in Escherichia coli K-12. J. Bacteriol. 1980; 143(3):1466–70. DOI: 10.1128/jb.143.3.1466-1470.1980.

18. Kado C.I., Liu S.T. Rapid procedure for detection and isolation of large and small plasmids. J. Bacteriol. 1981; 145(3):1365–73. DOI: 10.1128/jb.145.3.1365-1373.1981.

19. Siddique A.K., Zaman K., Akram K., Mutsuddy P., Eusof A., Sack R.B. Emergence of a new epidemic strain of Vibrio cholerae in Bangladesh. An epidemiological study. Trop. Geogr. Med. 1994; 46(3):147–50.

20. Bramucei M.G., Holmes R.K. Radial passive immune hemolysis assay for detection of heat-labile enterotoxin produced by individual colonies of Escherichia coli or Vibrio cholerae. J. Clin. Microbiol. 1978; 8(2):252–5. DOI: 10.1128/jcm.8.2.252-255.1978.

21. Шагинян И.А., Маракуша Б.И. Модификация метода пассивного иммунного гемолиза на плотной среде для выявления продукции термолабильных энтеротоксинов штаммами холерных вибрионов и кишечной палочки. Микробиология, эпидемиология и иммунология. 1983; (2):92–6.

22. Svennerholm A.M., Holmgren J. Identification of Escherichia coli heat-labile enterotoxin by means of a ganglioside immunosorbent assay (GM1-ELISA) procedure. Curr. Microbiol. 1978; 1:19–23. DOI: 10.1007/BF02601701.

23. Dutta N.K., Habbu M.K. Experimental cholera in infant rabbits: a method for chemotherapeutic investigation. Br. J. Pharmacol. Chemother. 1955; 10(2):153–9. DOI: 10.1111/j.1476-5381.1955.tb00074.x.

24. Cray W.C. Jr, Tokunaga E., Pierce N.F. Successful colonization and immunization of adult rabbits by oral inoculation with Vibrio cholerae O1. Infect. Immun. 1983; 41(2):735–41. DOI: 10.1128/iai.41.2.735-741.1983.

25. Pearson G.D., Mekalanos J.J. Molecular cloning of Vibrio cholerae enterotoxin genes in Escherichia coli K-12. Proc. Natl Acad. Sci. USA. 1982; 79(9):2976–80. DOI: 10.1073/pnas.79.9.2976.

26. Смирнова Н.И., Чеховская Г.В., Ливанова Л.Ф., Кобкова И.М. Штамм бактерий Escherichia coli КМ 147 – продуцент В-субъединицы холерного токсина. Патент РФ № 2238975, опубл. 27.10.2004. Бюл. № 30.