Генотипирование штаммов Francisella tularensis subsp. Mediasiatica с использованием маркерных SNP

Цель исследования – генотипирование штаммов Francisella tularensis subsp. mediasiatica с использованием маркерных SNP на основе данных полногеномного секвенирования. Материалы и методы. В работе использовали 50 полных геномов (WGS) штаммов F. tularensis subsp. mediasiatica из базы данных NCBI и 25 геномов, секвенирование которых проведено специалистами ФКУЗ Ростовский-на-Дону противочумный институт Роспотребнадзора. Выделение отдельных кластеров на дендрограмме проводили при значении бутстреп-поддержки как минимум >90 % (при использовании 1000 репликаций). Результаты и обсуждение. На репрезентативной выборке из 75 геномов F. tularensis subsp. mediasiatica были отобраны 5251 SNP, встречающиеся минимум у двух штаммов. В ходе биоинформационного анализа исключены геномы с более чем 500 SNP в участках, не охваченных WGS. На основе филогенетического анализа построена дендрограмма и выделены 11 крупных кластеров, названных по географическим локациям ранних или доминирующих штаммов, при бутстреп-поддержке >90 % (1000 репликаций). Для типирования штаммов в кластерах определены «маркерные» SNP, характерные для каждого кластера и его дочерних групп, но отсутствующие у остальных. Разработана программа «SNP Genotyper» для автоматического определения генотипа штаммов на основе маркерных SNP. Проведено изучение генетической вариабельности F. tularensis subsp. mediasiatica различного происхождения методом анализа wgSNP. Выявлено генетическое разнообразие штаммов subsp. mediasiatica, выделенных на территориях Алтайского края (Российская Федерация) и Республики Казахстан. На основе маркерных SNP разработан алгоритм для оперативного анализа WGS-данных геномов F. tularensis subsp. mediasiatica. Разработанная методика определения генетических линий может стать полезным инструментом как для оперативного анализа при выделении свежих штаммов, определения филогенетического родства штаммов, изучения генетического разнообразия популяции, так и при проведении ретроспективных исследований.

1. Gürcan Ş. Epidemiology of tularemia. Balkan Med. J. 2014; 31(3):3–10. DOI: 10.5152/balkanmedj.2014.13117.

2. Kilic S., Birdsell D.N., Karagöz A., Çelebi B., Bakkaloglu Z., Arikan M., Sahl J.W., Mitchell C., Rivera A., Maltinsky S., Keim P., Üstek D., Durmaz R., Wagner D.M. Water as source of Francisella tularensis infection in humans, Turkey. Emerg. Infect. Dis. 2015; 21(12):2213–6. DOI: 10.3201/eid2112.150634.

3. Dennis D.T., Inglesby T.V., Henderson D.A., Bartlett J.G., Ascher M.S., Eitzen E., Fine A.D., Friedlander A.M., Hauer J., Layton M., Lillibridge S.R., McDade J.E., Osterholm M.T., O’Toole T., Parker G., Perl T.M., Russell P.K., Tonat K.; Working Group on Civilian Biodefense. Tularemia as a biological weapon: medical and public health management. JAMA. 2001; 285(21):2763–73. DOI: 10.1001/jama.285.21.2763.

4. Degabriel M., Valeva S., Boisset S., Henry T. Pathogenicity and virulence of Francisella tularensis. Virulence. 2023; 14(1):2274638. DOI: 10.1080/21505594.2023.2274638.

5. Keim P., Johansson A., Wagner D.M. Molecular epidemiology, evolution, and ecology of Francisella. Ann. N.Y. Acad. Sci. 2007; 1105(1):30–66. DOI: 10.1196/annals.1409.011.

6. Timofeev V., Bakhteeva I., Titareva G., Kopylov P., Christiany D., Mokrievich A., Vergnaud G. Russian isolates enlarge the known geographic diversity of Francisella tularensis subsp. mediasiatica. PloS One. 2017; 12(9):e0183714. DOI: 10.1371/journal.pone.0183714.

7. Kudryavtseva T.Yu., Mokrievich A.N. Molecular-genetic bases of differences between tularaemia pathogen subspecies and Francisella tularensis subsp. holarctica strain typing. Mol. Genet. Microbiol. Virol. 2022; 37(1):10–8. DOI: 10.3103/s0891416822010049.

8. Aikimbaev M.A. Taxonomy of genus Francisella. Rep. Acad. Sci. Kaz. SSR. Ser. Biol. 1966; 5:42–4.

9. Olsufjev N.G., Meshcheryakova I.S. Subspecific taxonomy of Francisella tularensis McCoy and Chapin 1912. Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 1983; 33(4):872–4. DOI: 10.1099/00207713-33-4-872.

10. Timofeev V., Bakhteeva I., Mokrievich A., Vakhrameeva G., Gritskova E., Anisimov Yu., Rozhdestvensky E., Bazarova G., Zhumakaev R., Dyatlov I., Vergnaud G. The first finding of Francisella tularensis subsp. mediasiatica in Krasnoyarsk Territory, Siberia, and an update of the subspecies genetic diversity. Bacteria. 2022; 1(4):242–9. DOI: 10.3390/bacteria1040018.

11. Мокриевич А.Н., Тимофеев В.С., Кудрявцева Т.Ю., Уланова Г.И., Карбышева С.Б., Миронова Р.И., Вахрамеева Г.М., Губарева Т.И., Павлов В.М., Дятлов И.А. Выделение среднеазиатского подвида туляремийного микроба на территории Алтайского края. Проблемы особо опасных инфекций. 2013; (1):66–9. DOI: 10.21055/0370-1069-2013-1-66-69.

12. Shevtsov A., Izbanova U., Amirgazin A., Kairzhanova A., Dauletov A., Kiyan V., Vergnaud G. Genetic homogeneity of Francisella tularensis subsp. mediasiatica strains in Kazakhstan. Pathogens. 2024; 13(7):581. DOI: 10.3390/pathogens13070581.

13. Борзенко М.А., Зарва И.Д., Холин А.В., Куликалова Е.С., Мазепа А.В., Сынгеева А.К., Наумова К.В., Рождественский Е.Н., Базарова Г.Х., Санаров П.П., Полковников Е.С., Иваницкая Ю.Н., Сбитнева С.В., Красильникова Н.Ю., Пащенко И.Г. Современная эпидемиологическая ситуация по туляремии на Алтае. В кн.: Санитарно-эпидемиологическое благополучие населения и защита прав потребителей: региональные аспекты. Материалы Всероссийской научно-практической конференции. Иркутск: ООО «Типография «ИРКУТ»; 2022. С. 223–6.

14. Timofeev V., Titareva G., Bahtejeva I., Kombarova T., Kravchenko T., Mokrievich A., Dyatlov I. The comparative virulence of Francisella tularensis subsp. mediasiatica for vaccinated laboratory animals. Microorganisms. 2020; 8(9):1403. DOI: 10.3390/microorganisms8091403.

15. Larsson P., Elfsmark D., Svensson K., Wikström P., Forsman M., Brettin T., Johansson A. Molecular evolutionary consequences of niche restriction in Francisella tularensis, a facultative intracellular pathogen. PLoS Pathog. 2009; 5(6:)e1000472. DOI: 10.1371/journal.ppat.1000472.

16. Bankevich A., Nurk S., Antipov D., Gurevich A.A., Dvorkin M., Kulikov A.S., Lesin V.M., Nikolenko S.I., Pham S., Prjibelski A.D., Pyshkin A.V., Sirotkin A.V., Vyahhi N., Tesler G., Alekseyev M.A., Pevzner P.A. SPAdes: a new genome assembly algorithm and its applications to single-cell sequencing. J. Comput. Biol. 2012; 19(5):455–77. DOI: 10.1089/cmb.2012.0021.

17. Seemann T. Snippy: Fast Bacterial Variant Calling from NGS Reads. GitHub; 2022. [Электронный ресурс]. URL: https://github.com/tseemann/snippy.

18. Tamura K., Stecher G., Kumar S. MEGA11: Molecular Evolutionary Genetics Analysis version 11. Mol. Boil. Evol. 2021; 38(7):3022–7. DOI: 10.1093/molbev/msab120.

19. Huerta-Cepas J., Serra F., Bork P. ETE 3: reconstruction, analysis, and visualization of phylogenomic data. Mol. Boil. Evol. 2016; 33(6):1635–8. DOI: 10.1093/molbev/msw046.

20. Lärkeryd A., Myrtennäs K., Karlsson E., Dwibedi C.K., Forsman M., Larsson P., Sjödin A. CanSNPer: a hierarchical genotype classifier of clonal pathogens. Bioinformatics. 2014; 30(12):1762–4. DOI: 10.1093/bioinformatics/btu113.

21. Di Giallonardo F., Puglia I., Curini V., Cammà C., Mangone I., Calistri P., Cobbin J.C.A., Holmes E.C., Lorusso A. Emergence and spread of SARS-CoV-2 lineages B.1.1.7 and P.1 in Italy. Viruses. 2021; 13(5):794. DOI: 10.3390/v13050794.

22. Алиева Б., Ходжаева Г.А. Основные демографические показатели Республики Каракалпакстан. Экономика и социум. 2024; 6-2(121):843–6.