Разработка мультиплексной тест-системы для обнаружения и дифференциации Burkholderia mallei и Burkholderia pseudomallei методом ПЦР в режиме реального времени

Цель. Разработать мультиплексную тест-систему для выявления и дифференциации возбудителей сапа и мелиоидоза методом ПЦР с флуоресцентной детекцией в режиме реального времени, обладающую высокой чувствительностью и специфичностью. Материалы и методы. В работе использовано 104 штамма микроорганизмов, из них: 56 штаммов В. pseudomallei, 14 – B. mallei и 34 – гетерологичных видов микроорганизмов. Для определения аналитической чувствительности реакции амплификации исследовали серии 10-кратных разведений бактериальных взвесей B. pseudomallei и B. mallei в концентрации от 1·109 м.к./мл до 1·102 м.к./мл. Результаты и выводы. Сконструирована мультиплексная ПЦР тест-система, которая включает две пары праймеров и флуоресцентно-меченные зонды, обеспечивающие одновременное обнаружение и дифференциацию двух близкородственных видов патогенных буркхольдерий. В качестве ДНК-мишеней выбраны видоспецифичный для возбудителя сапа B. mallei фрагмент гена fliР, который кодирует белок биосинтеза флагеллина, а для B. pseudomallei видоспецифичный участок гена, кодирующий белок gp68. Проверка при исследовании штаммов патогенных буркхольдерий, близкородственных и гетерологичных микроорганизмов показала 100 % специфичность разработанной амплификационной тест-системы. Аналитическая чувствительность сконструированной мультиплексной ПЦР тест-системы для выявления возбудителя сапа составила 1·103 м.к./мл, а для возбудителя мелиоидоза – 1·104 м.к./мл. 

1. Прохватилова Е.В., Антонов В.А., Викторов Д.В., Илюхин В.И., Храпова Н.П., Ткаченко Г.А., Захарова И.Б., Плеханова Н.Г., Новицкая И.В., Кулаков М.Я., Замарина Т.В., Корсакова И.И., Савченко С.С., Бондарева О.С., Батурин А.А., Лемасова Л.В., Тетерятникова Н.Н., Белицкая Л.И. Оценка эффективности применения наборов реагентов для обнаружения возбудителя мелиоидоза при проведении внутреннего контроля качества лабораторных исследований в референс-центре по мониторингу за возбудителями сапа и мелиоидоза. Дальневосточный журн. инф. патологии. 2014; 25(25):128–32.

2. Brilhante R.S., Bandeira T.J., Cordeiro R.A., Grangeiro T.B., Lima R.A., Ribeiro J.F., Castelo-Branco D.S., Rodrigues J.L., Coelho I.C., Magalhães F.G., Rocha M.F., Sidrim J.J. Clinicalepidemiological features of 13 cases of melioidosis in Brazil. J. Clin. Microbiol. 2012; 50(10):3349–52. DOI: 10.1128/JCM.01577-12.

3. Currie B.J., Dance D.A., Cheng A.C. The global distribution of Burkholderia pseudomallei and melioidosis: an update. Trans. R. Soc. Trop. Med. Hyg. 2008; 102 Suppl 1:S1–4. DOI: 10.1016/S0035- 9203(08)70002-6.

4. Chen Y.S., Lin H.H., Mu J.J., Chiang C.S., Chen C.H., Buu L.M., Lin Y.E., Chen Y.L. Distribution of melioidosis cases and vi- able Burkholderia pseudomallei in soil: evidence for emerging me- lioidosis in Taiwan. J. Clin. Microbiol. 2010; 48(4):1432–4. DOI: 10.1128/JCM.01720-09 48.

5. Jamkhandi D.M., Alex R., George K. Melioidosis: a report of two cases. Natl. Med. J. India. 2014; 27(4):202–3.

6. Rainbow L., Hart C.A., Winstanley G. Distribution of type III secretion gene clusters in Burkholderia pseudomallei, B. thailan- densis and B. mallei. J. Med. Microbiol. 2002; 51(5):374–84.

7. Sonthayanon P., Krasao P., Wuthiekanun V., Panyim S., Tungpradabkul S. A simple method to detect and differentiate Burkholderia pseudomallei and Burkholderia thailandensis using spe- cific flagellin gene primers. Mol. Cell. Probes. 2002; 16(3):217–22.

8. Tomaso H., Pitt T.L., Landt O., Dahouk S.A., Scholz H.C., Reisinger E.C., Sprague L.D., Rathmann I., Neubauer H. Rapid presumptive identification of Burkholderia pseudomallei with real￾time PCR assays using fluorescent hybridization probes. Mol. Cell. Probes. 2005; 19(1):9–20.

9. Whitlock G.C., Estes D.M., Torres A.G. Glanders: off to the races with Burkholderia mallei. FEMS Microbiol. Lett. 2007; 277(2):115–22.

10. Winstanley C., Hart C. A. Presence of type III secretion genes in Burkholderia pseudomallei correlates with Ara– phenotypes. J. Clin. Microbiol. 2000; 38(2):883–5.

11. Varma-Basil M., E-Hajj H, Marras S.A., Hazbón M.H., Mann J.M., Connell N.D., Kramer F.R., Alland D. Molecular bea- cons for multiplex detection of four bacterial bioterrorism agents. Clin. Chem. 2004; 50(6):1060–2.

12. Yang S. Melioidosis research in China. Acta Trop. 2000; 77(2):157–65.