ОПТИМИЗАЦИЯ ТЕХНОЛОГИЧЕСКОЙ СХЕМЫ ПРОИЗВОДСТВА ПРЕПАРАТОВ ДЛЯ ГЕННОЙ ДИАГНОСТИКИ ОСОБО ОПАСНЫХ ИНФЕКЦИОННЫХ БОЛЕЗНЕЙ МЕТОДОМ ПОЛИМЕРАЗНОЙ ЦЕПНОЙ РЕАКЦИИ С ГИБРИДИЗАЦИОННО-ФЛУОРЕСЦЕНТНЫМ УЧЕТОМ РЕЗУЛЬТАТОВ


https://doi.org/10.21055/0370-1069-2017-3-105-109

Полный текст:


Аннотация

Цель: оптимизация технологической схемы получения препарата для генной диагностики чумы с гибридизационно-флуоресцентным учетом результатов, связанная с подбором условий синтеза и метода очистки входящих в состав набора олигонуклеотидных зондов, несущих метки флуорофора (6-карбоксифлуоресцеин) и гасителя флуоресценции (Black Hole Quencher-1), оценка их качества и внедрения новой технологической линии в производство.

Материалы и методы. Объектом для исследования являлся набор реагентов «Ген Yersinia pestis идентификация–РГФ» и входящие в его состав праймеры и зонд, обеспечивающие амплификацию hmsH гена. Синтез праймеров и зондов осуществляли в восьмиканальном синтезаторе ДНК ASM-800 (Биоссет, Россия) твердофазным фосфитамидным методом. Для проведения исследований использовали очистку полученных зондов либо с помощью электрофореза в 20 % полиакриламидном геле размером 20×20 или 8×10 см с последующей очисткой на RP-картриджах в полуавтоматическом режиме на системе OPS-201 и вручную, либо только с RP- картриджами вручную, либо методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ). Специфическую активность полученных зондов проверяли в полимеразной цепной реакции с использованием ДНК, выделенной из бактериальных суспензий штамма Yersinia pestis C-624 с концентрациями 1·103 – 1·106 м.к./мл.

Результаты и выводы. Оптимизирована технология синтеза и подобран метод очистки олигонуклеотидных зондов, несущих флуорофор-6-карбоксифлуоресцеин и гаситель флуоресценции Black Hole Quencher-1. Показана целесообразность использования для очистки таких олигонуклеотидов, либо комплекса ВЭЖХ, либо электрофореза в 20 % полиакриламидном геле с 7 М мочевиной и последующей хроматографией на RP-картриджах в ручном режиме. Внедрение оптимизированной технологической схемы при производстве препаратов для генной индикации идентификации особо опасных патогенов с гибридизационно-флуоресцентной детекцией позволит сократить сроки их изготовления на 50 % и снизить себестоимость на 66 %. 


Об авторах

А. В. Степанов
ФКУЗ «Российский научно-исследовательский противочумный институт «Микроб»
Россия
410005, Саратов, ул. Университетская, 46


Н. А. Осина
ФКУЗ «Российский научно-исследовательский противочумный институт «Микроб»
Россия
410005, Саратов, ул. Университетская, 46


Н. В. Майоров
ФКУЗ «Российский научно-исследовательский противочумный институт «Микроб»
Россия
410005, Саратов, ул. Университетская, 46


Список литературы

1. Куклев В.Е., Осина Н.А., Бугоркова Т.В., Кутырев В.В. Набор и способ для ускоренной идентификации чумного микроба с одновременной дифференциацией вирулентных и авирулентных штаммов Y. pestis, определением их плазмидного профиля. Патент РФ № 2473701. 2013.Бюлл. 3 от 27.01.2013.

2. Олиго Кальк: Программа для расчета свойств олигонуклеотидов (праймеров). Интернет-портал биологического факультета Белорусского Государственного Университета. http:// bio.bsu.by/molbiol/index.php?pg=oligocalc (дата обращения 24.04.2017).

3. Поллард Дж. Справочник по вычислительным методам статистики. М.: Финансы и статистика; 1982. 344 с.

4. Ke G., Zhu Z., Wang W., Zou Y., Guan Z., Jia S., Zhang H., Wu X., Yang C.J. A Cell-Surface-Anchored Ratiometric Fluorescent Probe for Extracellular pH Sensing. ACS Appl. Mater. Interfaces. 2014; 6(17):15329–34. DOI: 10.1021/am503818n.

5. Mullah B., Livak K., Andrus A., Kenney P. Efficient synthesis of double dye-labeled oligodeoxyribonucleotide probes and their application in a real time PCR assay. Nucleic Acids Res. 1998; 26(4):1026–31. DOI: 10.1093/nar/26.4.1026.

6. Tatarinova O.N., Lukyanova T.N., Zaitseva M.A., Veremeev K.Y., Karpov V.A., Chuvilin A.N., Petrunin D.D., Pozmogova G.E. Significance of Methods for Purification of Oligodeoxyribonucleotide Probes for the Efficiency of Gene Diagnosis by Real-Time PCR. Bull. Exp. Biol. Med. 2008; 145(3):312–6. DOI: 10.1007/s10517-008-0078-6.


Дополнительные файлы

Для цитирования: Степанов А.В., Осина Н.А., Майоров Н.В. ОПТИМИЗАЦИЯ ТЕХНОЛОГИЧЕСКОЙ СХЕМЫ ПРОИЗВОДСТВА ПРЕПАРАТОВ ДЛЯ ГЕННОЙ ДИАГНОСТИКИ ОСОБО ОПАСНЫХ ИНФЕКЦИОННЫХ БОЛЕЗНЕЙ МЕТОДОМ ПОЛИМЕРАЗНОЙ ЦЕПНОЙ РЕАКЦИИ С ГИБРИДИЗАЦИОННО-ФЛУОРЕСЦЕНТНЫМ УЧЕТОМ РЕЗУЛЬТАТОВ. Проблемы особо опасных инфекций. 2017;(3):105-109. https://doi.org/10.21055/0370-1069-2017-3-105-109

For citation: Stepanov A.V., Osina N.A., Mayorov N.V. OPTIMIZATION OF THE TECHNOLOGICAL SCHEME FOR THE PRODUCTION OF PREPARATIONS FOR GENE DIAGNOSTICS OF PARTICULARLY DANGEROUS INFECTIOUS DISEASES USING POLYMERASE CHAIN REACTION WITH HYBRIDIZATION-FLUORESCENT REGISTRATION OF RESULTS. Problems of Particularly Dangerous Infections. 2017;(3):105-109. (In Russ.) https://doi.org/10.21055/0370-1069-2017-3-105-109

Просмотров: 134

Обратные ссылки

  • Обратные ссылки не определены.


Creative Commons License
Контент доступен под лицензией Creative Commons Attribution 4.0 License.


ISSN 0370-1069 (Print)
ISSN 2658-719X (Online)