В работе рассмотрены современные представления о механизмах и факторах повреждений бактериальных клеток при лиофилизации и хранении сухих препаратов, представлены сведения о наиболее эффективных лиопротекторах и механизмах их защитного действия. Лиофилизация или высушивание из замороженного состояния – основной метод консервации бактерий в коллекциях культур и биологических ресурсных центрах. В процессе лиофилизации клетки подвергаются действию повреждающих стрессовых факторов. Низкие температуры, кристаллизация воды, осмотический стресс, изменения рН растворов, дегидратация вызывают повреждения клеточных структур и молекул. Окислительные реакции, протекающие в препаратах сухих клеток, изменяют состав и структуру липидов, белков, нуклеиновых кислот и, как следствие, снижают количество живых клеток при хранении. Одним из главных факторов, влияющим на жизнеспособность бактерий после лиофилизации и хранения, является состав защитной среды, с которой смешивают клетки перед консервацией. Использование защитных сред, содержащих углеводы, аминокислоты, восстановленное молоко, желатин и другие компоненты снижает вероятность повреждений клеточных компонентов, увеличивает гарантированный срок хранения бактерий.

Активатор плазминогена Yersinia pestis – поверхностная протеаза (Pla) кодируется видоспецифической плазмидой pPla. Этот фермент принадлежит к семейству белков омптинов и имеет β-баррельную структуру. Протеаза Pla осуществляет комплексное взаимодействие с системой гомеостаза организма хозяина и является важным фактором вирулентности возбудителя чумы. Представлены литературные данные об участии активатора плазминогена в развитии бубонной и легочной форм чумы. Описано участие R-формы ЛПС в проявлении активности протеазы Pla. Активатор плазминогена непосредственно способствует фибринолизу, активируя плазминоген, инактивируя ингибитор активатора плазминогена-1 (PAI-1) и α2-антиплазмин, а также активируемый тромбином ингибитор фибринолиза (TAFI). Прокоагулянтная активность белка Pla обусловлена разрушением ингибитора каскада тканевого фактора (TFPI). Представлены данные о непротеолитических функциях активатора плазминогена.

В 2009 г. в КНР от больного был выделен новый вирус, получивший название вирус острой лихорадки с тромбоцитопеническим синдромом (SFTS). Болезнь, вызываемая этим вирусом, характеризуется острой лихорадкой, поражениями респираторного и желудочно-кишечного тракта, сопровождается прогрессирующей тромбоцитопенией, лейкопенией, летальностью в 6–30 % случаев. Секвенирование генома выделенного возбудителя установило, что вирус SFTS относится к новой (третьей) группе рода Phlebovirus семейства Bunyaviridae. В настоящее время для специфической диагностики SFTS разработаны различные методы (обратная транскрипция-полимеразная цепная реакция, непрямой метод флуоресцирующих антител, иммуноферментный анализ). В обзоре рассмотрена разработка диагностических наборов и основные характеристики методов выявления возбудителя инфекции и специфических антител к нему.

Цель работы. Изучение иммунологической структуры горных сусликов на разных участках природной очаговости в Центрально-Кавказском природном очаге чумы.

Материалы и методы. Данные о результатах серологического исследования горных сусликов за 1974–1988, 2001–2004 гг. получены из ФКУЗ «Кабардино-Балкарская противочумная станция» Роспотребнадзора. С помощью Excel Microsoft Office 2010 проанализированы 63147 результатов исследований крови сусликов в РПГА и РНАг. Использованы статистические и математические методы.

Результаты и выводы. Установлено, что наибольшие доли сусликов, имеющих в крови антитела в низких титрах, характеризующие первичный контакт с чумной инфекцией, формируются на пиках эпизоотической активности. В горной степи восточной части очага это июнь, в западной, а также альпийской и субальпийской зонах восточной части – август. Животные с антителами в высоких тирах, т.е. вторично инфицированные, в большом числе появляются на пиках летальности горных сусликов. В горной степи это наблюдается в июне, т.е. одновременно с пиком эпизоотической активности, в западной части – в июне, но максимальная активность эпизоотий имеет место в августе. В альпийской и субальпийской зонах восточной части очага пики эпизоотической активности и летальности сусликов совпадают и приходятся на август. Выделение культур чумного микроба при наличии положительных результатов серологических исследований достоверно чаще наблюдается в горной степи долины р. Баксан, чем на других участках природной очаговости.

Энтемопаразитические нематоды являются естественными регуляторами численности блох – переносчиков чумы в природных очагах чумы и оказывают влияние на интенсивность эпизоотического процесса, протекающего в этих очагах.

Цель исследования. Изучение энтомопаразитических нематод из блох сусликов и полевок, собранных на территории Поволжского региона.

Материалы и методы. Представлены результаты морфологического и генетического анализа энтомопаразитических нематод – паразитов блох Citellophilus tesquorum, Аmphipsylla rossica и Ctenophthalmus secundus, собранных соответственно с малого суслика Spermophilus pygmaeus и общественной полевки Microtus socialis.

Результаты и выводы. Установлена идентичность морфологии паразитических самок нематод из всех трех видов блох и высокая степень сходства с ранее описанным видом Rubzovinema ceratophylla, паразитирующем в блохе C. tesquorum. На основании морфологического сходства и высокого процента гомологии нуклеотидных последовательностей генов рРНК (99,3–100 %) доказана принадлежность выделенных паразитических нематод из блох C. tesquorum, А. rossica и C. secundus к одному виду, обозначенному как Rubzovinema sp. и отличающемуся от ранее описанного моноксенного вида R. ceratophylla отсутствием строгой гостальной специфичности.

Цель исследований. Определение современных дислокации и размеров природных очагов чумы в Северо-Западном Прикаспии.

Материалы и методы. По результатам проведенного в 2013–2014 гг. полевого и камерального картографирования Прикаспийских песчаного и Северо-Западного степного очагов чумы изготовлены электронные карты секторов, расположенных на периферии очагов.

Результаты и выводы. Выявлено заметное уменьшение размеров природных очагов за счет распашки аридных пастбищ. Их новые, естественные границы на значительном протяжении представлены линейными элементами гидрографии. Там, где такие элементы отсутствуют, в качестве формализованных внешних границ приняты рамки секторов, в которых признаки энзоотии сохранились. Процесс глубокой и необратимой антропогенной трансформации ландшафтов привел к сокращению энзоотичных по чуме территорий: площадь степного очага чумы уменьшилась на 22 % и составляет 51152 кв. км, площадь песчаного – на 13 % и составляет 62510 кв. км. Распашка обширных площадей как способ коренного преобразования ландшафтов сделала эти земли непригодными для обитания малого суслика, полуденной и гребенщиковой песчанок, что является свидетельством полной утраты этими территориями признаков энзоотичности по чуме. Учет реального расположения и размеров природных очагов чумы в строго установленных границах, закрепленных на топографических картах и без труда идентифицируемых на местности, обеспечивает обоснованное планирование и проведение всего комплекса профилактических противочумных мероприятий. Новые пространственные параметры природных очагов предложены для внесения в официальные нормативно-методические документы, регламентирующие проведение эпидемиологического надзора за чумой.

Цель. Изучение влияния вакцинации против гепатита А на уровень заболеваемости гепатитом А в Республике Саха (Якутия).

Материалы и методы. Анализ статистических данных отчетных форм государственной статистической отчетности по инфекционной заболеваемости и проведению профилактических прививок против гепатита А с 1992 по 2015 год в Якутии.

Выводы и результаты. В результате проводимых в течение последних 14 лет в Республике Саха (Якутия) селективной иммунизации групп риска, заболеваемость гепатитом А снизилась за этот период в 38 раз. По итогам 2015 г. на территории зарегистрировано 15 случаев, показатель составил 1,6 на 100 тыс. населения, что ниже среднероссийских показателей в 2,8 раза. Проведенный анализ многолетней динамики заболеваемости гепатитом А на территории Республики Саха (Якутия) установил влияние вакцинопрофилактики гепатита А на эпидемический процесс гепатита А. С увеличением числа привитых уменьшается уровень заболеваемости. Особенно выражен эффект от иммунизации среди возрастной группы от 7 до 14 лет.

Цель работы. создание тест-системы, позволяющей проводить видовую идентификацию возбудителя бруцеллеза с помощью полимеразной цепной реакции с учетом результатов в режиме реального времени.

Материалы и методы. Проведен анализ литературных источников и нуклеотидных последовательностей Brucella spp. с помощью специализированного программного обеспечения для выбора ДНК -мишеней, специфичных для каждого вида бруцелл, разработан методический прием и набор реагентов для идентификации видовой принадлежности возбудителя бруцеллеза методом полимеразной цепной реакции с применением термоциклера с гибридизационно-флуоресцентным учетом результатов типа RotorGene.

Результаты и выводы. Разработана тест-система, позволяющая провести дифференциацию видов или группы видов бруцелл: B. abortus/B. ovis; B. melitensis; B. suis/B. canis; B. neotomae методом ПЦР с учетом результатов в режиме реального времени. В качестве ДНК -мишеней выбраны гены BR0262, BRA0541-0542, BMEII0711, которые полностью или частично делетированы у разных видов бруцелл.

Цель работы. Экспериментальное исследование влияния низкой температуры и дефицита питательных веществ на стабильность комплекса генетических локусов Vibrio cholerae Еltor.

Материалы и методы. В экспериментальных микрокосмах исследовалась стабильность комплекса генетических локусов (основные гены патогенности; участки генома, содержащие вариабельные тандемные повторы и сайты узнавания редкощепящих рестриктаз, определяющие VNTR- и PFGE-профиль изолятов соответственно; гены жизнеобеспечения холерного вибриона) четырех штаммов Vibrio cholerae Еltor на разных этапах инкубации.

Результаты и выводы. Установлено, что при культивировании исследуемых штаммов в условиях дефицита питательных веществ и низкой температуры произошло формирование клонов с измененным VNTR- и PFGE-профилями, частота обнаружения которых составила 4–8·10–2. Изменений в структуре генов «домашнего хозяйства» и утраты генов патогенности в составе мобильных генетических элементов не выявлено. Результаты исследования доказывают вероятность изменения анализируемых локусов генома V. cholerae в период пребывания микроорганизма в неблагоприятных условиях среды, что следует принимать во внимание при интерпретации результатов молекулярного типирования.

Для идентификации B. pseudomallei и B. mallei в лабораторной практике широко применяется автоматизированная система Vitek 2, основанная на сравнении биохимического профиля исследуемой бактериальной культуры с имеющейся базой данных.

Цель работы. Проведение расширенной фенотипической характеристики штаммов возбудителей сапа и мелиоидоза, поддерживаемых в коллекции ФКУЗ «Волгоградский научно-исследовательский противочумный институт» и анализа вариаций их биохимических профилей с использованием системы Vitek 2.

Материалы и методы. С помощью Vitek 2 (bioMerieux, Франция) проанализированы биохимические свойства 52 коллекционных штаммов B. pseudomallei и B. mallei, выращенных на L-агаре (Difco, США) и триптиказо-соевом агаре – ТСА (HiMedia, Индия).

Выводы и результаты. Большинство исследованных штаммов (31 из 40 B. pseudomallei и 8 из 12 B. mallei) идентифицированы с приемлемой для определения видовой принадлежности вероятностью (90–99 %). Процент правильной идентификации B. pseudomallei и B. mallei был выше при культивировании на L-агаре, чем на ТСА . В связи с вариабельностью биохимических признаков, отдельные штаммы показали нетипичные для своего вида результаты по определенным тестам (для штаммов B. pseudomallei – отсутствие активности β-N-ацетилглюкозаминидазы, β-N-ацетилгалактозаминидазы и способность к утилизации D-целлобиозы; для штаммов B. mallei – отсутствие активности L-пролинариламидазы и тирозинариламидазы, наличие активности глицинариламидазы, способность к утилизации сахарозы и D-трегалозы), что привело к их неправильной идентификации. Вероятность ошибочной диагностики микроорганизмов рода Burkholderia диктует необходимость дополнения идентификационной базы бактериологического анализатора Vitek 2 данными по биохимическим характеристикам штаммов, имеющих особенности в профиле.

Цель работы. Данная работа проведена с целью выявления специфических антител к вирусам Западного Нила, денге, ККГЛ и Чикунгунья в сыворотках крови людей – жителей провинции Киндиа Гвинейской Республики.

Материалы и методы. Полученные сыворотки исследовали методом иммуноферментного анализа (ИФА) для выявления антител класса IgG к вирусам денге, Западного Нила, ККГЛ и Чикунгунья.

Выводы и результаты. В результате работы выявлено 267 (82 %) положительных
образцов из 326, которые содержали иммуноглобулины класса G к этим арбовирусам. Полученные данные указывают на активную циркуляцию возбудителей лихорадок денге и Западного Нила на данной территории. Показана необходимость дальнейшего изучения как иммунной прослойки населения, так и возможных носителей и переносчиков арбовирусов с целью оптимизации подходов к проведению профилактических (противоэпидемических) мероприятий.

Цель работы. Оценка возможности применения различных сублимационных установок для лиофилизации патогенных микроорганизмов бактериальной природы и сравнительный анализ качества, полученных с их помощью препаратов коллекционных штаммов.

Материалы и методы. В качестве контрольных использовали четыре штамма патогенных микроорганизмов, относящихся к разным видам и использующихся в качестве тестовых при проверке качества питательных сред в диагностической деятельности. Их лиофилизацию осуществляли на четырех различных сублимационных аппара-тах коллекторного и камерного типов. Качество полученных препаратов лиофилизированных штаммов определяли путем установления жизнеспособности их клеток, а также с помощью ускоренного теста прогнозирования выживаемости лиофилизированных культур бактерий (тест термостабильности).

Результаты и выводы. Подобраны условия лиофилизации коллекционных тест-штаммов патогенных бактерий III–IV групп патогенности с помощью коллекторных аппаратов нового поколения Martin Christ Alpha 1-4 LDplus и Heto Power Dry. Проведен сравнительный анализ показателей жизнеспособности, выживаемости и прогнозируемых сроков хранения, полученных на них препаратов штаммов патогенных микроорганизмов с таковыми, лиофилизированными на аппарате системы К.Е.Долинова и программируемой сушки камерного типа Martin Christ Epsilon 2-6D. Установлено, что препараты микроорганизмов, высушенных на различных сублимационных установках, характеризуются высокой жизнеспособностью содержащихся в них бактериальных клеток и прогнозируемым сроком хранения от 4 до 105 лет, в зависимости от вида микроорганизма и типа лиофильной сушки.

Цель работы. Разработать набор для выявления антител классов IgM и IgG к вирусу Эбола методом иммуноферментного анализа (ИФА).

Материалы и методы. В качестве антигена использовали наработанный на культуре клеток штамм вируса Эбола Заир H.sapiens-wt/GIN/2015/Kalidie-Kindia-1022.

Выводы и результаты. Набор использован в работе бригады МК СПЭБ Роспотребнадзора в Гвинее при расследовании случаев болезни во время эпидемии лихорадки Эбола. Установлено, что специфические антитела класса G сохраняются у переболевших лихорадкой Эбола не менее 2 лет. Показано, что использование набора в лабораторной диагностике позволяет ИФА стать основным и подтверждающим лабораторным методом выявления лихорадки Эбола.

Цель исследования. Изучение влияния температуры и среды культивирования на сроки персистенции, сохранение ctx гена и ферментативную активность V. cholerae О1 различной токсигенности.

Материалы и методы. В работе использовали штаммы V. cholerae El Tor: Р-5879, Р-19613, а также штамм Р-19787.

Результаты и выводы. При изучении холерных вибрионов Эль Тор с разной генетической характеристикой установлено, что самая длительная выживаемость (19 сут) на минеральных
субстратах при 5 °С наблюдалась у токсигенных штаммов, тогда как атоксигенный штамм сохранялся не более 17 сут. В то же время холерные вибрионы могут длительное время сохраняться и даже размножаться в условиях пониженной температуры (не менее 10 °С) на минеральных субстратах. Токсигенные штаммы холерных вибрионов, независимо от среды и температуры культивирования, сохраняли в своем геноме ctx ген и ферментативную активность в течение всего срока наблюдения в эксперименте. Такая продолжительная персистенция холерных вибрионов при низких температурах на минеральных субстратах может рассматриваться как возможность сохранения токсигенных штаммов холерных вибрионов при заносе больными или вибрионосителями.

Цель исследования. Разработка и апробация новых биотехнологических приемов в технологии получения живой туляремийной вакцины.

Материалы и методы: Штамм Francisella tularensis 15 НИИЭГ использовали в качестве штамма-продуцента, штамм F. tularensis 503 – в качестве тест-заражающего. Проводили культивирование штамма-продуцента на плотных и жидких питательных средах, тангенциальную ультрафильтрацию на ультра-микрофильтрационной установке «Вива-флоу», лиофилизацию в сублимационной сушильной установке FreeZone 2,5 L.

Результаты и обсуждение. Использование сконструированной жидкой питательной среды на основе ферментативного гидролизата фибрина и применение глубинного культивирования штамма-продуцента позволило увеличить выход биомассы. На этапе концентрирования культуры туляремийного микроба методом микрофильтрации через мембраны с размером пор 0,2 мкм в режиме тангенциального потока жидкости увеличено содержание микробных клеток и проведено освобождение от остатков питательной среды. Проведенный сравнительный анализ полученных по экспериментальной технологии лабораторных серий вакцины с коммерческим препаратом вакцины туляремийной живой показал их соответствие нормативным свойствам. Установлено, что применение новой жидкой питательной среды, глубинного культивирования, способов концентрирования и сепарации биомассы не оказывает отрицательного влияния на основные свойства живой туляремийной вакцины и в дальнейшем позволит в значительной степени повысить технологичность производства.

Цель исследований. Разработка и медицинские испытания «Тест-системы иммуноферментной для детекции чумного микроба моноклональной (ИФАП естФ1-М)».

Материалы и методы. В работе использованы материалы для постановки сэндвич-варианта ИФА. В качестве диагностического иммунореагента применяли МКА 1В3 к FI Y. pestis. Для определения чувствительности и специфичности сконструированной иммуноферментной тест-системы исследованы образцы 24 природных и генетически модифицированных pFra+ и pFra– штаммов Y. pestis и 56 штаммов гетерологичных бактерий семейства Enterobacteriaceae.

Результаты и выводы. На основе моноклональных антител к капсульному антигену Yersinia pestis разработана «Тест-система иммуноферментная для детекции чумного микроба моноклональная (ИФАП естФ1-М)», которая характеризуется высокой специфичностью и позволяет выявлять капсулосодержащие штаммы возбудителя чумы в образцах биологического материала и проводить идентификацию чистых культур с чувствительностью 5·105–1·106 м.к./мл. Она не уступает по основным параметрам препарату сравнения «Иммуноглобулинам диагностическим чумным флуоресцирующим адсорбированным лошадиным», лиофилизату для диагностических целей, производства ФКУЗ РосНИПЧИ «Микроб», обладая при этом такими преимуществами, как объективный учет результатов анализа и возможность их документирования. Диагностическая моноклональная тест-система (ИФАП естФ1–М) зарегистрирована в Росздравнадзоре № РЗН 2013/711 от 31.05.2013 г. в соответствии с приказом № 2161-Пр. 113 от 31.05.2013 г. и допущена к обращению на территории Российской Федерации.

Цель работы. Изучение влияния активатора, окислителя и деблокирующего раствора на количественный выход олигонуклеотидов при производстве тест-системы для выявления ДНК Vibrio cholerae (ctxA+) методом полимеразной цепной реакции «ГенХол».

Материалы и методы. В качестве объекта исследований были выбраны праймеры ctx2 и ctx3, входящие в состав «Тест-системы для выявления ДНК Vibrio cholerae (ctxA+) методом полимеразной цепной реакции «ГенХол». Для проведения исследований использовали экспериментальные составы растворов для деблокирования, активатора и окислителя и «стандартные» растворы, рекомендованные производителем ООО «Биоссет». Специфическую активность синтезированных праймеров ctx2 и ctx3 проверяли с использованием трех штаммов V. cholerae 569B, M-1298, 158 и E. coli 12226 О-55, готовили бактериальную суспензию возбудителей с конечной концентрацией 1·103 – 1·101 м.к./мл. ДНК выделяли методом нуклеосорбции в присутствии гуанидинизотиоцианата.

Результаты и вывод. Показана возможность оптимизации производства генодиагностических препаратов путем увеличения выхода олигонуклеотидов при фосфорамидитном синтезе за счет использования в качестве деблокирующего раствора 3 % дихлоруксусной кислоты в дихлорметане и окислителя – 0,1 М раствор йода в уксусной кислоте и пиридине в соотношении 1:9. Применение таких реагентов увеличивает выход конечного продукта (праймеров) на 6 и 95 % соответственно. Использование усовершенствованной технологии синтеза позволит снизить затраты на дорогостоящие импортные реагенты и повысить количество выпускаемых генодиагностических препаратов для детекции особо опасных патогенов.

Изучен видовой состав и зараженность возбудителями природно-очаговых инфекций иксодовых клещей, собранных на флаг в 2014–2015 гг., на острове Русском (Приморский край). Среди 817 особей зарегистрированы Ixodes persulcatus, I. pavlovskyi, Haemaphysalis concinna, H. japonica douglasi. Больше всего нимф (46 экз.) собрано у I. pavlovskyi. Методом иммуноферментного анализа установлен достоверно больший уровень вирусофорности I. pavlovskyi (2,2 %), по сравнению с I. persulcatus (0,5 %). Методом полимеразной цепной реакции достоверных различий по уровню вирусофорности между видами не выявлено: I. pavlovskyi – 1,3, I. persulcatus – 0,5 %. Этим же методом в клещах зарегистрирована ДНК боррелий (I. pavlovskyi – 25,1, I. persulcatus – 46,4 %), анаплазм (I. pavlovskyi – 1,9, I. persulcatus – 5,7 %) и эрлихий (I. pavlovskyi –1,3, I. persulcatus – 7,2 %). В нимфах I. pavlovskyi выявлены только РНК клещевого энцефалита и ДНК боррелий, причем их зараженность спирохетами (45,7 %) достоверно выше, чем имаго. Природный очаг клещевого энцефалита на о. Русском оценивается как малоактивный, а иксодовых клещевых боррелиозов – как активный. Высокий уровень инфицированности боррелиями нимф дает основания ожидать в 2016 г. рост риска заболеваемости иксодовыми клещевыми боррелиозами для людей, посещающих остров в период наибольшей активности клещей (май–июнь).